Введение
Ввиду малой эффективности антибактериальных лекарственных средств, применяемых для лечения гнойновоспалительных заболеваний, вызываемых синегнойной палочкой (Pseudomonas aeruginosa), более 100 лет предпринимаются исследования по созданию иммунопрофилактических вакцин. Полученные классическими методами варианты, обладая удовлетворительной иммуногенностью, но содержащие примеси бактериального липополисахарида, оказывались реактогенными, что препятствовало их применению в клинической практике. С развитием биотехнологии и генной инженерии появилось новое направление в разработке препаратов - вакцин на основе рекомбинантных протективных антигенов. Многие экспериментальные антисинегнойные вакцины в настоящее время тестируются в доклинических и клинических испытаниях [1, 2]. Перспективными оказались препараты, при создании которых использовались нетоксичные и иммуногенные антигены P. aeruginosa. Использование генно-инженерных методов позволяет создавать универсальные и безопасные технологии получения протективных рекомбинантных белков.
На основе результатов многолетних исследований иммунобиологических свойств ряда рекомбинантных белков P. aeruginosa, проведенных в ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова, получены варианты, среди которых наибольший интерес для последующего исследования представляет белок слияния OprF-aTox-OprI [3].
Известно, что для усиления иммуногенных свойств рекомбинантных белков используют различные адъюванты [4]. С этой целью в состав вакцин включают гель гидроокиси алюминия, который является сорбентом и обеспечивает продолжительность презентации антигенов для клеток иммунной системы. Эффективность протективного действия зависит от условий сорбции и соотношения белок/сорбент.
На доступность эпитопов влияют конформационные изменения антигена, которые могут наступить в процессе его получения (наработка материала в неродственном штамме-продуценте, очистка рекомбинантного продукта). При разработке вакцин на основе рекомбинантных белков важно учитывать нативность белка и технологичность процесса сорбции. Оптимальное соотношение компонентов в препарате способно существенно усилить иммуногенность. Находящиеся в доступном состоянии эпитопы быстрее распознаются клетками иммунной системы, в результате чего запускается каскад реакций, направленных на защиту организма.
Подтверждением эффективности выбранного в качестве оптимального соотношения белок/сорбент могут служить данные по выживаемости животных (при использовании модели на мышах и экспериментального заражения) и по экспрессии генов, определяющих факторы развития врожденного иммунитета.
Материал и методы
Экспериментальные иммуногены. При выполнении работы использовали полученный в лаборатории протективных антигенов ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова рекомбинантный белок слияния OprF-aTox-OprI, сорбированный в разных дозах (50, 75 и 100 мкг белка) на геле гидроокиси алюминия в соотношениях 1 : 1, 1 : 2 и 1 : 3, и прошедшую доклинические исследования рекомбинантную вакцину синегнойную (РВС), которая представляет собой комплекс рекомбинантных белков OprF и анатоксина P. aeruginosa, сорбированных на геле гидроокиси алюминия [2].
Экспериментальные животные. В экспериментах использовали самок белых беспородных мышей весом 16-18 г, полученных из филиала "Андреевка" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Животных содержали в виварии ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова. Уход за животными осуществляли в соответствии с ГОСТом 33216-2014 ("Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами") и Федеральным законом РФ "Об ответственном обращении с животными" (№ 498-ФЗ от 27.12.2018).
Оценка протективных свойств. Самок белых беспородных мышей весом 16-18 г иммунизировали двукратно с двухнедельным интервалом внутрибрюшинно. Экспериментальное инфицирование животных проводили внутрибрюшинно различными дозами живой вирулентной культуры P aeruginosa штамма PA-103 в объеме 0,5 мл. Дозы заражения готовили путем разведения смытой изотоническим раствором хлорида натрия с агаризованной среды Мюллер-Хинтона (Amresco, США) культуры, используя стандарт мутности ("Ормет", Россия) и спектрофотометр Genesys 6 (Thermo scientific, США). ЛД50 рассчитывали по формуле Кербера в модификации Ашмарина-Воробьева [5]. Индекс эффективности (ИЭ) определяли как отношение ЛД50 опытной и контрольной групп.
Выделение перитонеальных макрофагов. Взятие перитонеального экссудата проводили после курса иммунизаций за сутки до заражения, на 2-е и 5-е сутки после заражения индивидуально у нескольких мышей в каждой группе по общепринятой практике [6].
Определение уровня экспрессии генов. Клеточную суспензию, содержащую макрофаги, помещали в лизирующий раствор из коммерческого набора "РИБО-сорб" ("Интерлабсервис", Россия) и выделяли РНК согласно инструкции. При постановке полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) использовали наборы реагентов "ОТ-1" для обратной транскрипции ("Синтол", Россия) и "ПЦР-Микс" ("Синтол", Россия), и следующие пары праймеров:
TGAGAGGTGGTGTAAGCCATGC;
Defb2 - CTGCTGCTGATATGCTGCCTC,
TAAACTTCCAACAGCTGGAGTGG;
Nlrc4 - GTGTTTGCAGCACTTGGACCTC,
CTGGTGAAAGGTTACAGGCTGC;
Casp1 - GGCACATTTCCAGGACTGACTG,
GCAAGACGTGTACGAGTGGTTG;
Asc - AGGAGATCCAGCAGACGTGTGA,
ATGCCTGCCATCTCGACTTCCA
Экспрессию целевого гена рассчитывали относительно гена домашнего хозяйства Actb, кодирующего β-актин, по методу "ДАО" [7]. Для сравнения экспрессии целевого гена у животных внутри одной группы в разные дни после иммунизации был применен критерий Вилкоксона. При сравнении уровней экспрессии генов между разными группами экспериментальных животных использовался непараметрический G-критерий Манна-Уитни.
Результаты
На первом этапе было сформировано четыре группы по 50 животных. Животным 1-й и 2-й групп двукратно с двухнедельным интервалом вводили рекомбинантный белок слияния OprF-aTox-OprI в соотношении белок/сорбент 1 : 3 в иммунизирующих дозах 50 и 75 мкг белка, соответственно. 3-й группе по той же схеме вводили препарат сравнения - рекомбинантную вакцину синегнойную (РВС). 4-я группа была представлена неиммунизированными животными. После окончания курса иммунизаций животным вводили живую вирулентную культуру P. aeruginosa штамма PA-103 в дозах от 200 до 12,5 миллионов микробных клеток (млн м.кл.) для опытных групп и от 100 до 6,25 млн м.к. для контрольных животных. В течение 7 дней в группах вели учет павших животных и на основании этих данных рассчитывали ЛД50 и ИЭ, как описано в разделе "Материал и методы".
Апробированное соотношение белок/сорбент 1 : 3 обеспечивало максимальный защитный эффект при введении РВС, однако в случае с гибридным белком применение соотношения 1 : 3 привело к снижению протективной активности независимо от иммунизирующей дозы по сравнению с вакцинацией РВС (табл. 1).
Таблица 1. Результаты оценки иммуногенности рекомбинантного белка слияния OprF-aTox-OprI при соотношении белок/сорбент 1 : 3 в сравнении с вакциной РВС
&hide_Cookie=yes)
Примечание. РВС - рекомбинантная вакцина синегнойная; ИЭ - индекс эффективности.
При подборе оптимального содержания сорбента по отношению к белку были апробированы два варианта соотношения (1 : 1 и 1 : 2) и расширен диапазон иммунизирующих доз. Количество групп было увеличено до 7. Первым 3 группам двукратно с двухнедельным интервалом вводили рекомбинантный белок слияния OprF-aTox-OprI в соотношении белок/сорбент 1 : 1 в иммунизирующих дозах 50, 75 и 100 мкг белка соответственно. 4-й, 5-й и 6-й группам по той же схеме вводили рекомбинантный белок слияния OprF-aTox-OprI в соотношении белок/сорбент 1 : 2 в иммунизирующих дозах 50, 75 и 100 мкг белка. 7-я группа была представлена неиммунизированными животными. Последующее заражение живой вирулентной культурой P. aeruginosa штамма PA-103 и расчет ЛД50 и ИЭ проводили аналогично первому опыту.
Как видно из табл. 2, максимальный защитный эффект выявлен при соотношении белок/сорбент 1 : 1 в иммунизирующей дозе 50 мкг белка (ИЭ - 4,3). А при соотношении белок/сорбент 1 : 2 проявлялся дозозависимый эффект.
Таблица 2. Результаты оценки иммуногенности рекомбинантного белка слияния OprF-aTox-OprI в вариантах соотношения белок/сорбент 1 : 1 и 1 : 2
&hide_Cookie=yes)
Примечание. ИЭ - индекс эффективности.
Эффективность вышеуказанных соотношений белок/сорбент (выживаемость зараженных иммунизированных животных) подтверждена исследованиями по оценке уровня экспрессии генов сенсорных рецепторов врожденного иммунитета, таких как TLR4 и NLRC4, и противомикробного пептида BD2.
У животных собирали макрофаги за сутки до заражения, на 2-е и 5-е сутки после заражения и выполняли ПЦР, как указано в разделе "Материал и методы". Определяли экспрессию генов Defb2, Tlr4, Nlrc4, Asc и Casp1 в группах здоровых незараженных и неиммунизированных мышей, группах неиммунизированных мышей и группах иммунизированных и зараженных мышей. Полученные данные сравнивали с показателями у мышей, иммунизированных рекомбинантным белком слияния OprF-aTox-OprI в соотношениях белок/сорбент 1 : 1 и 1 : 2, и у зараженных мышей (контроль). Количество мРНК выражали в относительных единицах.
У мышей, иммунизированных рекомбинантным белком в соотношениях 1 : 1 и 1 : 2, не выявлено достоверных различий в уровне экспрессии гена Tlr4, а по сравнению со здоровыми неиммунизированными животными выявлена тенденденция к увеличению экспрессии гена Tlr4.
После заражения мышей P. aeruginosa на 2-е и 5-е сутки повторно определяли уровень экспрессии гена Tlr4. Пик увеличения экспрессии у иммунизированных животных приходился на 2-е сутки, тогда как на 5-е сутки экспрессия Tlr4 снижалась до показателей перед заражением. У животных контрольной группы (неиммунизированных) возрастание экспрессии гена Tlr4 начиналось к 5-м суткам после инфицирования.
При сравнении экспрессии гена Tlr4 у здоровых, контрольных и иммунизированных мышей на 2-е сутки после инфицирования показано, что в группе животных, иммунизированных белком OprF-aTox-OprI в соотношении с сорбентом 1 : 1, наблюдался самый высокий уровень экспрессии целевого гена: в 24 раза выше, чем у контрольных мышей (р = 0,049); в 8 раз выше, чем у здоровых мышей (р = 0,049), и в 3 раза выше, чем у мышей, иммунизированных препаратом с соотношением белок/сорбент 1 : 2 (рис. 1).
&hide_Cookie=yes)
Рис. 1. Экспрессия гена Tlr4 макрофагами здоровых (а), контрольных (б) и иммунизированных мышей рекомбинантным белком слияния OprF-aTox-OprI в соотношениях с сорбентом 1 : 2 (в) и 1 : 1 (г) на 2-е сутки после инфицирования P. aeruginosa
Здесь и на рис. 2-5: экспрессию целевых генов нормализовали на ген домашнего хозяйства Actb.
Достоверных различий уровня экспрессии гена противомикробного пептида Р-дефензина BD2 у мышей, иммунизированных рекомбинантным белком OprF-aTox-OprI в соотношениях с сорбентом 1 : 1 и 1 : 2, не выявлено, а по сравнению со здоровыми животными имелась тенденция к увеличению экспрессии гена Defb2.
При сравнении экспрессии гена Defb2 на 2-е сутки после инфицирования показано, что у животных, иммунизированных препаратом с соотношением белок/сор-бент 1 : 2, уровень экспрессии был значительно выше, чем у остальных групп мышей:
- в 14 раз больше, чем у здоровых животных (р = 0,04);
- в 11 раз по отношению к группе мышей, иммунизированных препаратом с соотношением 1 : 1 (р = 0,04);
- в 24 раза больше по сравнению с инфицированными животными.
Экспрессия гена Defb2 у животных, получавших препарат, содержащий рекомбинантный белок OprF-aTox-OprI в соотношении с сорбентом 1 : 1, была сопоставима с таковой у здоровых и контрольных животных (рис. 2).
&hide_Cookie=yes)
Рис. 2. Экспрессия гена Defb2 макрофагами здоровых (а), контрольных (б) и иммунизированных мышей рекомбинантным белком слияния OprF-aTox-OprI в соотношениях с сорбентом 1 : 2 (в) и 1 : 1 (г) на 2-е сутки после инфицирования P. aeruginosa
Была также изучена экспрессия генов инфламмасом-ного комплекса Nlrc4, Asc и Caspl у здоровых и иммунизированных животных в динамике.
Достоверных различий уровня экспрессии генов инфламмасомного комплекса у животных, которым вводили рекомбинантный белок OprF-aTox-OprI в соотношениях с сорбентом 1 : 1 и 1 : 2, не выявлено, однако по сравнению со здоровыми животными имелась тенденция к увеличению экспрессии генов Nlrc4, Asc и Caspl.
Показано, что у всех иммунизированных животных после заражения P. aeruginosa наблюдалось усиление экспрессии генов Nlrc4, Asc и Casp1 на 2-е сутки. На 5-е сутки уровень экспрессии генов снижался у животных, получавших вариант в соотношении с сорбентом 1 : 2, и возрастал либо оставался неизменным у мышей, иммунизированных OprF-aTox-OprI 1 : 1, тогда как у контрольных мышей максимум экспрессии наблюдался к 5-м суткам.
Сравнение уровней экспрессии генов Nlrc4, Asc и Casp1 у здоровых, контрольных и иммунизированных белком OprF-aTox-OprI в соотношениях с сорбентом 1 : 2 и 1 : 1 мышей на 2-е сутки после инфицирования P. aeruginosa показало, что у животных, вакцинированных препаратом с соотношением с сорбентом 1 : 2, уровень экспрессии гена Nlrc4 был значительно выше, чем у остальных групп мышей. Статистически достоверное повышение выявлено между иммунизированными животными, экспрессия Nlrc4 оказалась в 5 раз выше в группе с соотношением белок/сорбент 1 : 1 (р = 0,04) (рис. 3).
&hide_Cookie=yes)
Рис. 3. Экспрессия гена Nlrc4 макрофагами здоровых (а), контрольных (б) и иммунизированных рекомбинантным белком слияния OprF-aTox-OprI в соотношениях с сорбентом 1 : 2 (в) и 1 : 1 (г) мышей на 2-е сутки после инфицирования P. aeruginosa
У мышей, иммунизированных вариантом препарата с соотношением 1 : 1, уровень экспрессии генов Asc и Casp1 был выше, чем у животных остальных групп (рис. 4, 5).
&hide_Cookie=yes)
Рис. 4. Экспрессия гена Asc макрофагами здоровых (а), контрольных (б) и иммунизированных рекомбинантным белком слияния OprF-aTox-OprI в соотношениях с сорбентом 1 : 2 (в) и 1 : 1 (г) мышей на 2-е сутки после инфицирования P. aeruginosa
&hide_Cookie=yes)
Рис. 5. Экспрессия Casp1 макрофагами здоровых (а), контрольных (б) и иммунизированных рекомбинантным белком слияния OprF-aTox-OprI в соотношениях с сорбентом 1 : 2 (в) и 1 : 1 (г) мышей на 2-е сутки после инфицирования P. aeruginosa
Обсуждение
Ранее при разработке вакцины РВС для сорбции выбрано соотношение белок/сорбент 1 : 3, обеспечивающее максимальный защитный эффект (ИЭ 3,0-3,3) [2]. По аналогии проведена сорбция рекомбинантного белка слияния OprF-aTox-OprI в двух дозах (50 и 75 мкг) на гидроксид алюминия. Иммунизирующая доза, соответствующая 50 мкг белка, выбрана по результатам предшествующих исследований протективной активности рекомбинантного белка слияния, а доза 75 мкг соответствовала содержанию антигенов в одной дозе рекомбинантной вакцины РВС. Для сравнения защитного эффекта сорбированных препаратов в исследовании использовали серию вакцины РВС.
Используемое при сорбции рекомбинантного белка слияния OprF-aTox-OprI соотношение белок/сорбент, равное 1 : 3, привело к снижению протективной активности вне зависимости от иммунизирующей дозы (табл. 1). Снижение протективной активности при увеличении содержания сорбента, возможно, происходило из-за прочного связывания белка с сорбентом, которое препятствует взаимодействию антигенов с клетками иммунной системы. Уменьшение содержания сорбента и расширение диапазона иммунизирующих доз (50, 75 и 100 мкг белка в одной дозе) свидетельствовали о важности оптимизации соотношения белок/сорбент. Иммунизирующая доза 50 мкг белка при соотношении с сорбентом 1 : 1 обеспечивала максимальный защитный эффект (ИЭ - 4,3). Дозозависимый эффект прослеживали при иммунизации препаратом с соотношением белок/сорбент 1 : 2. При иммунизирующей дозе 50 мкг белка ИЭ соответствовал 2,3 и увеличился до 3,5 при введении препарата в дозе 100 мкг белка, что, по-видимому, связано с большей доступностью антигена для клеток иммунной системы. По нашему мнению, для дальнейшего изучения рекомбинантного белка слияния как кандидатной синегнойной вакцины соотношение белок/сорбент 1 : 1 представляется наиболее перспективным, потому что максимальный протективный эффект достигается при минимальной концентрации белка, а содержание сорбента не превышает значений, допустимых при производстве вакцин.
Результаты оценки защитных свойств рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI в вариантах сорбции 1 : 1 и 1 : 2 подтверждены исследованием экспрессии генов противомикробного пептида и ключевых сенсоров врожденного иммунитета.
У иммунизированных мышей активация врожденного звена иммунитета и распознавание антигена происходили раньше, чем в контрольной группе (неиммунизированных инфицированных животных). Ранее это было показано для рекомбинантного анатоксина, который активировал экспрессию TLR2, TLR4 и TLR9, стимулировал продукцию провоспалительных и противовоспалительных цитокинов [8].
После курса иммунизаций у животных опытных групп не выявлено достоверных различий в уровне экспрессии гена Tlr4, но имелась тенденция к увеличению экспрессии по сравнению с группой здоровых неиммунизированных незараженных мышей. Влияние иммунизации как средства подготовки организма подтверждается данными по изучению уровня экспрессии Tlr4 на 2-е сутки после заражения. При введении животным рекомбинантного белка слияния OprF-aTox-OprI в варианте сорбции 1 : 1 он оказался в 24 раза выше, чем в контрольной группе, и в 3 раза, чем при иммунизации соотношением 1 : 2. Эти результаты согласуются с исследованиями, в которых показано, что TLR4 имеет решающее значение в устойчивости организма к P. aeruginosa, так как его дефицит приводит к усилению продукции провоспалительных цитокинов и снижению продукции iNOs и BD2 [9, 10].
Данные, полученные при изучении экспрессии гена Defb2, неодназначны. При изначальном более высоком уровне экспрессии у мышей, иммунизированных препаратом с соотношением белок/сорбент 1 : 1, на 2-е сутки после заражения пик экспрессии наблюдался в группе с вариантом препарата белок/сорбент 1 : 2: в 14 раз выше по сравнению со здоровыми животными (р = 0,04), в 11 раз - по сравнению с группой, получившей другой вариант препарата (р = 0,04), и в 24 раза - по сравнению с инфицированными животными.
Дефензины играют важную роль как во врожденном, так и в адаптивном иммунитете благодаря своим антимикробным, регуляторным и хемотаксическим эффектам. BD2 способствует клиренсу P. aeruginosa путем ингибирования макрофагов через понижающую регуляцию EGR1 и c-FOS, а исследования in vivo продемонстрировали индивидуальные и комбинированные эффекты BD2 и BD3, регулирующие бактериальную нагрузку и продукцию ИФН-γ, MIP-2, ИЛ-1β, ФНОα, индуцибельной NO-синтазы (iNOS), TLR2, TLR4, MyD88 и NF-kB [11]. В наших экспериментах бактериальная нагрузка увеличивалась на 5-е сутки после инфицирования путем нокдауна Defb2 или Defb3, что свидетельствовало о важной роли дефензинов в клиренсе P. aeruginosa [12].
Данные по уровню экспрессии генов инфламмасомного комплекса также неоднозначны. NLRC4, относящийся к семейству NOD-подобных рецепторов (NLR), рассматривается как необходимый сенсорный комплекс, запускающий активацию врожденного иммунитета [13, 14]. Известно, что за активацией и олигомеризацией рецепторов NLR следует рекрутирование, кластеризация и аутоактивация каспазы через белковый адаптер ASC [15]. Активация CASP1 опосредует процессинг и секрецию провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1β и ИЛ-18 [16].
Грам-отрицательные бактерии, в частности P. aeruginosa, запускают активацию инфламмасомы NLRC4, обеспечивая более эффективную элиминацию патогена [17, 18]. Данные, полученные ходе настоящей работы, свидетельствуют об увеличении экспрессии всех компонентов инфламмасомного комплекса (NLRC4, ASC, CASP1) у иммунизированных мышей ко 2-м суткам, тогда как у контрольных (неиммунизированных инфицированных) животных усиление экспрессии наблюдалось позднее. Это указывает на более раннее распознавание патогена и эффективный ответ иммунной системы на введение P aeruginosa. Необходимо отметить, что в целом динамика экспрессии генов Nlrc4, Asc, Caspl совпадала у мышей, иммунизированных рекомбинантным белком OprF-aTox-OprI в соотношениях с сорбентом 1 : 1 и 1 : 2, однако более выраженные изменения наблюдались при использовании препарата с соотношением белок/адъювант 1 : 1.
Полученные результаты согласуются с данными, касающимися титров специфических антител к отдельным компонентам рекомбинантного белка слияния OprF-aTox-OprI в сыворотке иммунизированных мышей [19], поскольку известно, что активация врожденного иммунитета является необходимым условием для развития адаптивного иммунитета, как клеточного, так и гуморального.
Заключение
По результатам проведенной работы выявлено влияние содержания сорбента в препарате на проявление защитных свойств и активацию экспрессии генов противомикробного пептида и ключевых сенсоров врожденного иммунитета. Из полученных результатов следует, что соотношение белка и гидроксида алюминия 1 : 1 и иммунизирующая доза 50 мкг белка для рекомбинантного белка слияния OprF-aTox-OprI P. aeruginosa эффективны в активации экспрессии генов Tlr4, Nlrc4, Defb2 и обладают большей протективной активностью.
Вклад авторов
Сбор и обработка материала - Зимина Е.М., Калошин А.А., Меркушова Е.Д.; статистическая обработка -Зимина Е.М., Меркушова Е.Д.; написание текста - Зимина Е.М.; редактирование - Михайлова Н.А., Ганковская Л.В.
Литература
1. Rello J., Krenn C.G., Locker G., Pilger E., Madl C. et al. A randomized placebo-controlled phase II study of a Pseudomonas vaccine in ventilated ICU patients. Crit. Care. 2017; 21 (1): 22. DOI: https://www.doi.org/10.1186/s13054-017-1601-9.
2. Михайлова Н.А., Калошин А.А., Зимина Е.М., Солдатенкова А.В., Поддубиков А.В. Доклинические исследования рекомбинантной вакцины синегнойной. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; 6: 31-7. DOI: https://www.doi.org/10.36233/0372-9311-2018-6-31-37.
3. Калошин А.А., Солдатенкова А.В., Зимина Е.М., Михайлова Н.А. Получение слитых рекомбинантных белков OprF-ΔOprI, ΔOprF-ΔOprl и OprF-aTox-ΔOprl Pseudomonas aeruginosa. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017; 5: 32-8. DOI: https://www.doi.org/10.36233/0372-9311-2017-5-32-38.
4. Хаитов Р.М. Иммуномодуляторы: мифы и реальность. Иммунология. 2020; 41 (2): 101-6. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-2-101-106.
5. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград : Медгиз, 1962: 180 с.
6. Ковальчук Л.В. (ред.), Игнатьева Г.А. (ред.), Ганковская Л.В. (ред.) Иммунология. Практикум. Учебное пособие. Москва : "Гэотар-Медицина", 2015: 176 с.
7. Ребриков Д.В. (ред.), Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семенов П.А., Савилова А.М., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. ПЦР "в реальном времени". Москва : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2000: 223 с.
8. Солдатенкова А.В., Ахматова Н.К., Михайлова Н.А. Влияние рекомбинантного анатоксина на эффекторы иммунного ответа у мышей. Иммунология. 2012; 33 (5): 245-9.
9. Huang X., Du W., McClellan S.A., Barrett R.P., Hazlett L.D. TLR4 is required for host resistance in Pseudomonas aeruginosa keratitis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2006; 47 (11): 4910-6. DOI: https://www.doi.org/10.1167/iovs.06-0537.
10. Awasthi S., Singh B., Ramani V., Xie J., Kosanke S. TLR4-interacting SPA4 peptide improves host defense and alleviates tissue injury in a mouse model of Pseudomonas aeruginosa lung infection. PLoS One. 2019; 14 (1). Published 2019 Jan 28. DOI: https://www.doi.org/10.1371/journal.pone.0210979.
11. Wu Y., Li D., Wang Y., Liu X., Zhang Y. et al. Beta-Defensin 2 and 3 Promote Bacterial Clearance of Pseudomonas aeruginosa by Inhibiting Macrophage Autophagy through Downregulation of Early Growth Response Gene-1 and c-FOS. Front. Immunol. 2018; 9: 211. Published 2018 Feb 13. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fimmu.2018.00211.
12. Wu M., McClellan S.A., Barrett R.P., Zhang Y., Hazlett L.D. Beta-defensins 2 and 3 together promote resistance to Pseudomonas aeruginosa keratitis. J. Immunol. 2009; 183 (12): 8054-60. DOI: https://www.doi.org/10.4049/jimmunol.0902140.
13. Пирожков С.В., Литвицкий П.Ф. Инфламмасомные болезни. Иммунология. 2018; 39 (2-3): 158-65. DOI: https://www.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-2-3-158-165.
14. Chen K.W., Grob C.J., Sotomayor F.V., Stacey K.J., Tschopp J. et al. The neutrophil NLRC4 inflammasome selectively promotes IL-1beta maturation without pyroptosis during acute Salmonella challenge. Cell Reports. 2014; 8: 570-82.
15. Schroder K., Tschopp J. The inflammasomes. Cell. 2010; 140: 821-32.
16. Lovewell R.R., Patankar Y.R., Berwin B. Mechanisms of phagocytosis and host clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 2014; 306 (7): L591-L603. Published 2014 Apr 1. DOI: https://www.doi.org/10.1152/ajplung.00335.2013.
17. Mariathasan S., Newton K., Monack D.M., Vucic D., French D.M. et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 2004; 430: 213-8.
18. Miao E.A., Ernst R.K., Dors M., Mao D.P., Aderem A. Pseudomonas aeruginosa activates caspase 1 through Ipaf. Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105: 2562-7.
19. Зимина Е.М., Калошин А.А., Михайлова Н.А. Слитый рекомбинантный белок OprF-aTox-OprI Pseudomonas aeruginosa: получение и исследование иммунобиологических свойств. Цитокины и воспаление. 2017; 16 (4): 66-9.