Субъекты привлекались к биомедицинским исследованиям только после получения письменного согласия индивидуума на добровольное участие в исследовании в виде подписанного информированного согласия [17]. Одновременно участники исследования подписывали согласие на обработку персональных данных [18]. Исследование одобрено локальным комитетом по этике ЮУрИБФ ФМБА России в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации "Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека" с поправками 2008 г., протокола Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г. и в соответствии со статьями 20, 22, 23 Федерального закона "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации" от 21 ноября 2011 г. № 323-ФЗ (ред. от 21.07.2014).
Рис. 1. Структура хронических заболеваний в изученных группах
I - Инфекционные и паразитарные болезни; II - Новообразования; III - Болезни эндокринной системы, расстройства питания, нарушения обмена и иммунитета; IV - Болезни крови; V -Психические расстройства; VI - Болезни нервной системы; VII - Болезни системы кровообращения; VIII - Болезни органов дыхания; IX - Болезни органов пищеварения; X - Болезни мочеполовой системы; XI - Осложнения беременности; XII - Болезни кожи и подкожной клетчатки; XIII - Болезни костно-мышечной системы и соединительной ткани; XIV -Врожденные аномалии; XV - Отдельные состояния, возникшие в перинатальном периоде; XVI - Симптомы, признаки и неточно обозначенные состояния.
Основную группу составили 29 человек: 23 (79,3 %) женщины, 6 (20,7 %) мужчин, подвергшихся внутриутробному облучению; в группу сравнения включены 27 человек: 25 (92,6 %) женщин, 2 (7,4 %) мужчин (в соответствии с описанными выше критериями).
Средний возраст на момент обследования - 66,9 (SD - 1,8) года в основной группе и 65,2 (SD - 5,2) года в группе сравнения.
В исследовании использованы поглощенные в костном мозге (КМ) дозы внешнего γ-излучения дозиметрической системы работников ПО "Маяк" [19]. Средняя суммарная поглощенная в КМ доза внешнего γ-излучения матери за период беременности составила 0,24 (SD - 0,11) Гр.
Цитофлуориметрический анализ. Содержание основных субпопуляций лимфоцитов определяли с помощью проточной цитофлуориметрии. Определялись следующие субпопуляции лимфоцитов: CD3+CD45+ (Т-лимфоциты), CD3+CD4+CD45+ (Т-хелперы-индукторы), CD3+CD8+CD45+ (цитотоксические Т-лимфоциты,), CD3-CD16+CD45+CD56+ (натуральные киллеры - НК-клетки), CD3+CD16+CD45+CD56+ (НКТ-клетки) CD45+CD3-CD19+CD5+ (В-лимфоциты), CD3+CD4+CD25+CD45+ (активированные Т-хелперы - ранняя активация лимфоцитов), CD3+CD45+HLA-DR+ (активированные Т-лимфоциты - поздняя активация лимфоцитов). Иммунный статус оценивали методом проточной цитометрии на цитофлуориметре "Navios" (BeckmanCoulter, США) по стандартизованной технологии оценки лимфоцитарного звена иммунитета [20, 21]. Для проведения анализа у индивидуумов отбирали образцы крови объемом 2 мл в пробирки c литийгепарином. В исследовании использовали следующие конъюгаты моноклональных антител с флуорохромами (BeckmanCoulter, США): CD HLA-DR с PE; CD3/CD16+56 с FITC/PE; CD3-FITC/CD16+CD56-PCD19 с FITC; CD25 с PE, CD4-ECD, CD5 с PC7, CD3 c APC, CD8 с ECD.
Подготовку образцов для цитофлуориметрического анализа проводили следующим образом:
1. Помещали раствор моно- или поликлональных антител, меченных флуорохромом, в количестве 5 мкл в пробирку для цитофлуориметрического анализа (12 х 75 мм).
2. Добавляли в пробирку для цитофлуориметрического анализа (12 х 75 мм) 100 мкл периферической крови.
3. Аккуратно перемешивали при помощи вихревого встряхивателя "BioSan Type Vortex V-1 plus" (Латвия) в течение 1-3 с и инкубировали в защищенном от света месте в течение 40 мин.
4. Проводили лизис эритроцитов при помощи лизирующих растворов VersaLyse Lysing Solution (BeckmanCoulter, США) согласно инструкции фирмы-производителя.
5. Проводили анализ окрашенного образца на проточном цитофлуориметре с использованием ранее подготовленных протоколов.
Статистическая обработка. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 10. Для оценки характера распределения параметров использовали метод Колмогорова-Смирнова. Для оценки верности нулевой гипотезы при исследовании субпопуляционного состава лимфоцитов использовали непараметрический критерий Манна-Уитни, при оценке распространенности хронических заболеваний - критерий х2. Для оценки корреляционной зависимости использовали непараметрический ранговый коэффициент корреляции Спирмена.
Результаты
В табл. 1 представлена характеристика исследованных групп. Статистически значимых различий по полу, возрасту, возрасту беременности матерей, проценту курящих не выявлено.
Таблица 1. Характеристика исследованных групп
Примечание. M- среднее; Me - медиана: (Q1; Q3) - 25-й и 75-й перцентили (первый и третий квартиль); ДИ - доверительные интервалы для медианы.
Анализ структуры хронических заболеваний в изучаемых группах на момент взятия крови показал, что первое место занимают болезни системы кровообращения, второе и третье - болезни нервной системы и органов чувств и болезни эндокринной системы, расстройства питания, нарушения обмена и иммунитета; четвертое - болезни костно-мышечной системы и соединительной ткани (рис. 1).
Следует отметить, что среди лиц обеих изучаемых групп во II классе болезней (новообразования) зарегистрированы только доброкачественные новообразования, так как лиц со злокачественными заболеваниями в исследуемые группы не включали.
Распространенность хронических заболеваний различных классов статистически значимо не отличалась в исследованных группах, за исключением болезней костно-мышечной системы и соединительной ткани (класс XIII) и симптомов, признаков и неточно обозначенных состояний (класс XVI) (табл. 2).
Таблица 2. Распространенность хронических заболеваний в изученных группах (на 1000 человек)
Примечание. * - статистически значимые различия (р < 0,05) с группой сравнения.
Результаты анализа субпопуляционного состава лимфоцитов в изучаемых группах представлены в табл. 3.
Таблица 3. Субпопуляции лимфоцитов у лиц основной группы и группы сравнения
Примечание. * - p = 0,054 (по критерию Манна-Уитни); M- среднее; Me - медиана: (Q1; Q3) - 25-й и 75-й перцентили (первый и третий квартиль); ДИ - доверительные интервалы для медианы.
В результате исследования установлено, что содержание основных субпопуляций лимфоцитов статистически значимо не различалось между группами. Относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих маркер ранней активации CD25, в основной группе имело тенденцию к снижению (р = 0,054) по отношению к группе сравнения. Корреляционный анализ позволил установить тенденцию к снижению этого показателя с увеличением суммарной поглощенной в КМ дозы внешнего γ-излучения матери в период беременности (рис. 2).
Рис. 2. Корреляционная зависимость относительного содержания T-клеток, экспрессирующих маркер ранней активации CD25, в % от суммарной поглощенной в костном мозге (КМ) дозы внешнего γ-излучения матери в период беременности, Гр
Обсуждение
Структура хронической заболеваемости в исследованных группах соответствовала структуре хронической заболеваемости в Российской Федерации [22]. Для подтверждения факта повышенной распространенности болезней костно-мышечной системы и соединительной ткани необходимы дальнейшие исследования с большей статистической мощностью.
Полученные нами результаты согласуются с данными исследования субпопуляционного состава лимфоцитов у внутриутробно облученных лиц, проживавших в бассейне реки Теча и подвергшихся хроническому радиационному воздействию во внутриутробном и постнатальном периоде в результате сбросов жидких радиоактивных отходов ПО "Маяк" [15].
Известно, что активация Т-лимфоцитов и клеточный иммунный ответ модулируется ИЛ-2 посредством связывания с соответствующим поверхностным клеточным рецептором. Высокоаффинные рецепторы представляют собой гетеродимеры, состоящие из полипептидных α-, β- и γ-цепей. Цепь с молекулярной массой 55 кДа, также известная как активирующий Т-клетки антиген или CD25 - это уникальная субъединица высокоаффинного рецептора ИЛ-2. Покоящиеся T-клетки экспрессируют небольшое количество рецепторов к ИЛ-2, однако при активации их экспрессия быстро возрастает. Часть CD25+-Т-клеток - это CD25+CD4+Foxp3+-Т-регуляторные клетки, которые активно поддерживают аутотолерантность [23, 24]. Снижение числа этих клеток может наблюдаться при врожденных иммунодефицитах [23], аутоиммунных процессах [25, 26], аллергических заболеваниях [27], атеросклерозе и артериальной гипертензии [28], лечении иммунодепрессантами [29, 30]. В эксперименте на животных показана радиочувствительность этих клеток к внешнему γ-облучению [31, 32].
Данные о влиянии облучения на CD3+CD4+CD25+-лимфоциты, полученные в настоящей работе, согласуются с результатами экспериментальных исследований [31, 32], но пока их следует интерпретировать с осторожностью. Требуются дальнейшие исследования содержания CD4+CD25+Foxp3+- и других субпопуляций лимфоцитов, входящих в состав исследованной субпопуляции CD3+CD4+CD25+-Т-клеток, с расширением групп и увеличением статистической мощности исследования.
Заключение
В результате обследования лиц, подвергшихся внутриутробному облучению, не выявлено отклонений в основных субпопуляциях лимфоцитов. Обнаружена тенденция к снижению относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих маркер ранней активации CD25, у лиц, подвергшихся внутриутробному облучению, с увеличением суммарной поглощенной в КМ дозы внешнего γ-излучения в период беременности матери.
Вклад авторов
Концепция и дизайн исследования - Рыбкина В. Л., Кириллова Е.Н., Жунтова Г.В.; сбор и обработка материала - Синельщикова О. А., Адамова Г.В.; статистическая обработка - Ослина Д.С.; написание текста - Рыбкина В.Л.; редактирование - Азизова Т.В., Жунтова Г.В.
Литература
1. ICRP publication 84. International Commission on Radiological Protection. Pregnancy and medical radiation. Ann. ICRP. 2000; 30 (1): 1-43.
2. Ярилин А.А. Радиация и иммунитет. Радиационная биология. Радиоэкология. 1997; 37 (4): 597-603.
3. Ильин Л. А. Радиационная медицина. Москва : АТ; 2004. 992 с.
4. ICRP publication 118. ICRP on tissue reactions /early and late effects of radiation in normal tissues and organs-threshold doses for tissue reactions in a radiation protection context. Ann. ICRP. 2012; 41 (1/2): 1-332. DOI: https://www.doi.org10.1016/j.icrp.2012.02.001.
5. UNSCEAR 2006 Report. Effects of ionizing radiation. New York: United Nations. 2009; 2: 1-334.
6. Пальоха Е.А., Саенко А.С., Леках И.В., Леонова О. Показатели иммунного статуса у лиц, облученных внутриутробно и в раннем детском возрасте в результате аварии на ЧАЭС. Радиационная биология. Радиоэкология. 2010; 50 (2): 165-170.
7. Балева Л.С., Яковлева И.Н., Сипягина А.Е., Карахан Н.М., Карпеева Е.Е., Буянкин Е.Е., Сускова В.С. Клинико-иммунологические нарушения у детей различных когорт наблюдения, подвергшихся действию радиационного фактора на различных этапах онтогенеза. Радиационная биология. Радиоэкология. 2011; 51 (1): 7-19.
8. Finch S.C. A review of immunological and infectious disease studies at ABCC-RERF. Hiroshima: Radiation Effects Research Foundation. 1981.
9. Вологодская И.А., Окладникова Н.Д. Оценка иммунного статуса персонала ПО "Маяка" и их потомков (F1 и F2 поколение). Гигиенические, дозиметрические и медико-биологические аспекты отдаленных эффектов хронического облучения. Труды и материалы Юбилейной научной конференции. Озерск. 2003: 82-83.
10. Рыбкина В.Л., Жунтова Г.В., Азизова Т.В. Компоненты системы комплемента, иммуноглобулины и цитокины у внутриутробно облученных лиц. Иммунология. 2016; 37 (3): 162169.
11. Шубик В.М., Кирюшкин В.Н., Косенко М.М. Состояние иммунологической реактивности у подростков в отдаленный период после радиационного воздействия. Бюллетень Радиационной Медицины. 1971; 2: 49-54.
12. Аклеев А.В., Киселева М.Ф. Медико-биологические и экологические последствия радиоактивного загрязнения реки Теча. Москва : ФУ Медбиоэкстрем при Минздраве РФ. 2001.
13. Аклеев А.В., Дегтева М.О. Состояние иммунной системы в отдаленные сроки у людей, подвергшихся воздействию продуктов деления урана в антенатальном и раннем постнатальном периодах. Изменения основных иммунологических параметров. Бюллетень Радиационной Медицины. 1985; 3: 96.
14. Шведов В. Л., Аклеев А. В. Состояние иммунитета при хроническом поступлении в организм 90Sr. В кн. Радиобиология стронция-90. Челябинск. 2001.
15. Аклеев А.А. Особенности функционального состояния иммунной системы в отдаленном периоде у лиц, подвергшихся хроническому облучению in utero. Российский иммунологический журнал. 2017; 2 (20): 93-96.
16. Azizova T.V., Day R.D., Wald N., Muirhead C.R., O’Hagan J.A., Sumina M.V., Belyaeva Z.D., Druzhinina M.B., Teplyakov I.I., Se-menikhina N.G., Stetsenko L.A., Grigoryeva E.S., Krupenina L.N., Vlasenko E.V. The "clinic" medical-dosimetric database of Mayak production association workers: structure, characteristics and prospects of utilization. Health Physics. 2008; 94 (5): 449-58. DOI: https:// www.doi.org/10.1097/01.HP.0000300757.00912.a2.
17. Федеральный закон от 21 ноября 2011 № 323-ФЗ "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации".
18. Федеральный закон от 27 июля 2006 № 152-ФЗ "О персональных данных".
19. Vasilenko E.K. , Scherpelz R.I., Gorelov M.V., Strom D.J., Smetanin M.Y. External dosimetry reconstruction for Mayak workers. In: AAHP Special Session Health Physics Society Annual Meeting. Salt Lake City. 2010. Available at: http://www.hps1.org/aahp/public/AAHP_Special_Sessions/2010_Salt_Lake_City/pm-1.pdf (Accessed 20 March 2018).
20. Хайдуков С.В., Байдун Л.А., Зурочка А.В., Тотолян А.А. Стандартизованная технология "Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с применением проточных цитофлуориметров-анализаторов" // Российский иммунологический журнал. 2014; 8 (17) (4): 974-92.
21. Зурочка А.В. Хайдуков С.В., Кудрявцев И.В., Черешнев В.А. Проточная цитометрия в биомедицинских исследованиях. Екатеринбург: РИО УрО РАН. 2018. 720 с.
22. Здравоохранение в России. 2019: Стат. сб. Москва : Росстат. 2019. 170 с.
23. Caudy A.A., Reddy S.T., Chatila T., Atkinson J.P., Verbsky J.W. CD25 deficiency causes an immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked-like syndrome, and defective IL-10 expression from CD4 lymphocytes. Journal of allergy and clinical immunology. 2007; 119: 482-7. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.jaci.2006.10.007.
24. Morris J.C., Waldmann T.A. Advances in interleukin 2 receptor targeted treatment. Ann rheum dis. 2000; 59 (Suppl 1): 109-114. DOI: https://www.doi.org/10.1136/ard.59.suppl_1.i109.
25. Liang M., Liwen Z., Yun Z., Yanbo D., Jianping C. The imbalance between Foxp3+Tregs and Th1/Th17/Th22 Cells in Patients with Newly Diagnosed Autoimmune Hepatitis. Journal of Immunology Research. 2018; 2018: 3753081. DoI: https://www.doi.org/10.1155/2018/3753081.
26. Yu Q., Xu M., Yu F., Jin Y. CD4 + CD25 + regulatory T cells as a therapeutic target in rheumatoid arthritis. Central-European Journal of Immunology. 2014; 39 (1): 100-3. DOI: https://www.doi.org/10.5114/ceji.2014.42133.
27. Machura E., Mazur B., Pieniążek W., Karczewska K. Expression of naive/memory (CD45RA/CD45RO) markers by peripheral blood CD4+ and CD8+ T cells in children with asthma. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 2008; 56 (1): 55-62. DOI: https://www.doi.org/10.1007/s00005-008-0005-6.
28. Kasal D.A., Barhoumi T., Li M.W., Yamamoto N., Zdanovich E., Rehman A. et al. T regulatory lymphocytes prevent aldosterone-induced vascular injury. Hypertension. 2012; 59: 324-30. DOI: https://www.doi.org/10.n61/HYPERTENSIONAHA.in.181123.
29. Secor E.R. Jr., Singha A., Guernseya L.A., McNamaraa J.T., Zhanb L., Maulik N., Thrall R.S. Bromelain treatment reduces CD25 expression on activated CD4+ T cells in vitro. Int. Immunopharma-cology. 2009; 9 (3): 340-346. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j. intimp.2008.12.012.
30. Zhang Y., McClellan M., Efros L., Shi D., Bielekova B. Daclizumab reduces CD25 levels on T cells through monocyte-mediated trogocytosis. Multiple Sclerosis Journal. 2014; 20 (2): 156-164. DOI: https://www.doi.org/10.1177/1352458513494488.
31. Caoa M., Cabrera R., Xua Y., Liub C., Nelson D. Gamma irradiation alters the phenotype and function of CD4+ CD25+ regulatory T cells. Cell Biol Int. 2009; 33 (5): 565-71. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.cellbi.2009.02.007.
32. Caoa M., Cabrera R., Xu Y., Liu C., Nelson D. Different radiosensitivity of CD4+ CD25+ regulatory T cells and effector T cells to low dose gamma irradiation in vitro. Int. J. Radiat Biol. 2011; 87 (1): 71-80. DOI: https://www.doi.org/10.3109/09553002.2010.518208.