Двойственный эффект композиций аминокислот на антибактериальную функцию нейтрофильных гранулоцитов человека
РезюмеВведение. Известно, что композиции аминокислот для парентерального питания проявляют иммуномодулирующее действие в отношении Т- и В-лимфоцитов, фагоцитов.
Цель исследования - изучить влияние композиций аминокислот на антибактериальные функции нейтрофильных гранулоцитов периферической крови человека (нейтрофилов) в различных экспериментальных условиях.
Материал и методы. Нейтрофилы преинкубировали с композициями аминокислот Амин или Вамин 14, затем добавляли форбол-миристат-ацетат (ФМА) и методом проточной цитометрии оценивали "респираторный взрыв" в нейтрофилах. В другой модели нейтрофилы инкубировали с бактериями (St. aureus) в соотношении 1 : 10 или 10 : 1, отмывали, инкубировали с композициями аминокислот, еще раз отмывали, лизировали, высевали на мясо-пептонный агар для учета колоний, образуемых выжившими бактериями.
Результаты. Амин и Вамин 14 оказывали слабое иммуностимулирующее действие на "респираторный взрыв" в нейтрофилах, активированных ФМА. Добавление композиций аминокислот к нейтрофилам, фагоцитировавшим бактерии при соотношении нейтрофилы/бактерии 1 : 10, приводило к увеличению количества колоний, образуемых выжившими бактериями. При соотношении нейтрофилы/бактерии 10 : 1 исследованные композиции аминокислот усиливали бактерицидность нейтрофилов, вызывая уменьшение количества выживших бактерий, формирующих колонии. Прямое добавление композиций аминокислот усиливало образование колоний бактериями.
Заключение. Композиции аминокислот Амин и Вамин 14 усиливают рост бактерий, в том числе фагоцитированных нейтрофилами, при соотношении клетки/бактерии 1 : 10, но стимулируют бактерицидность нейтрофилов, фагоцитировавших St. aureus, при соотношении клетки/бактерии 10 : 1, а также в тесте индукции "респираторного взрыва" в нейтрофилах, активированных ФМА.
Ключевые слова:композиция аминокислот Амин; композиция аминокислот Вамин 14; нейтрофилы крови человека; "респираторный взрыв"; бактерицидность
Для цитирования: Потапнев М.П., Андреев С.В., Гончарова Н.В., Вяткина О.И., Бердина Е.Л., Гапанович В.Н. Двойственный эффект композиций аминокислот на антибактериальную функцию нейтрофильных гранулоцитов человека. Иммунология. 2023; 44 (1): 28-37. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-1-28-37
Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта № 20210507 Министерства здравоохранения Республики Беларусь.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Потапнев М.П., Андреев С.В.; сбор и обработка материала - Андреев С.В., Вяткина О.И.; проточная цитометрия - Гончарова Н.В.; работа с бактериальными культурами - Вяткина О.И.; статистическая обработка данных - Андреев С.В., Гончарова Н.В.; написание текста - Андреев С.В., Бердина Е.Л., Гончарова Н.В.; редактирование текста - Гапанович В.Н., Потапнев М.П.
Введение
Аминокислоты как основной элемент парентерального питания являются важным компонентом поддержания гомеостаза организма. Они выступают субстратом для синтеза белков и функциональных метаболитов, участвующих в выработке энергии [1]. Аминокислоты обладают иммуномодулирующим действием, особенно при применении у иммунокомпрометированных пациентов отделений реанимации и интенсивной терапии [2]. Изучение иммуномодулирующих свойств аминокислот с середины 1970-х гг. показало, что значимыми для поддержания иммунного гомеостаза являются аминокислоты с разветвленной цепью (BCAA) - лейцин, изолейцин, валин [3]. Повышенные концентрации BCAA стимулируют продукцию активных форм кислорода (АФК) мононуклеарами крови человека [4]. Среди обычных (conditional) аминокислот (СEAAs: аргинин, глицин, цистеин, глутамин, пролин, серин, тирозин) наибольшее внимание уделяется глутамину - важнейшему регулятору (стимулятору) роста клеток в организме, участвующему в метаболизме нейтрофилов, макрофагов, лимфоцитов. Трипептид, образующийся из глицина, глутаминовой кислоты и цистеина, является предшественником глутатиона и проявляет антиоксидантные свойства путем взаимодействия с АФК. У экспериментальных животных он стимулирует фагоцитоз и бактерицидную активность нейтрофилов [5]. Аргинин является одним из CEAAs, усиливающих воспалительный ответ макрофагов и гранулоцитов [6]. Обеспечение клеток-эффекторов иммунных реакций аминокислотами происходит за счет сенсоров, в качестве которых выступают mTORC1 (mechanistic target of rapamycin) и GCN2 (non-repressed kinase 2), вызывающие асимметрично повышенное потребление аминокислот преимущественно Т-клетками и миелоидными клетками, особенно при их активации [7].
Основой антибактериальной функции фагоцитов является кислород-зависимый "респираторный взрыв", связанный с никотинамидадениндинуклеотидфосфат
(НАДФН)-оксидазой и продукцией АФК [8-11]. Антибактериальную функцию фагоцитов в экспериментальных условиях оценивают с использованием разных подходов, в том числе по изменению (усилению) "респираторного взрыва" либо по гибели бактерий, наиболее часто Staphylococcus aureus [10-12]. Использование нескольких систем оценки антибактериальной функции фагоцитов позволяет оценить разные механизмы иммуномодулирующего действия исследуемых препаратов, включая композиции аминокислот.
Цель исследования - изучить влияние композиций аминокислот на антибактериальные функции нейтрофильных гранулоцитов крови человека в различных экспериментальных условиях in vitro.
Материал и методы
Материал. Для исследования использовали периферическую кровь (ПК) здоровых лиц - доноров крови РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий (РНПЦ ТиМБ). Забор образцов крови проводился в соответствии с решением Комитета по этике РНПЦ ТиМБ от 10.04.2020 (заседание № 1) и на основании подписанного информированного согласия донора крови. Забор ПК производили с помощью вакутайнеров с K2ЭДТА (Guangzhou Improve Medical Instruments Co., Ltd, Китай). Нейтрофильные гранулоциты выделяли из ПК по методу R. Hallgren и G. Stalenheim [13]. В ПК вносили 6 % декстран в соотношении 2 : 1 и инкубировали при 37 оС в течение 40-60 мин. После осаждения эритроцитов отобранную лейкоцитарную фракцию центрифугировали в течение 5 мин при 100 g. Нижнюю часть плазмы, обогащенную нейтрофилами (степень чистоты - 64-71 %), переносили в чистую пробирку и ресуспендировали в среде RPMI-1640 (4 оС), содержащей 2 % сыворотки АВ-группы. Концентрацию клеток доводили до 2 млн/мл при подсчете на гематологическом анализаторе Sysmex KX-21N (Sysmex Corp., Япония).
В исследованиях использовали следующие композиции аминокислот:
· VaminTM 14/Вамин 14 (Fresenius Kabi, Швеция). Состав готовой лекарственной формы (ГЛФ): аланин - 12,0 г, аргинин - 8,4 г, аспарагиновая кислота - 2,5 г, цистеин/цистин - 420 мг, глутаминовая кислота - 4,2 г, глицин - 5,9 г, гистидин - 5,1 г, изолейцин - 4,2 г, лейцин - 5,9 г, лизин - 6,8 г, метионин - 4,2 г, фенилаланин - 5,9 г, пролин - 5,1 г, серин - 3,4 г, треонин - 4,2 г, триптофан - 1,4 г, тирозин - 170 мг, валин - 5,5 г; ледяная уксусная кислота, вода для инъекций до 1000 мл. Теоретическая осмоляльность - 1145 мОсмоль/кг, рН - 5,6. Содержание азота - 13,5 г на 1000 мл.
· Амин (экспериментальная серия 230221, государственное предприятие "НПЦ ЛОТИОС", Беларусь). Состав ГЛФ: аланин - 4,00 г, лейцин - 3,52 г, лизина моногидрохрорид - 2,80 г, валин - 2,48 г, глицин - 2,48 г, пролин - 2,20 г, фенилаланин - 2,08 г, изолейцин - 2,00 г, метионин - 1,80 г, треонин - 1,80 г, гистидин - 1,68 г, глутаминовая кислота - 1,60 г, серин - 0,92 г, триптофан - 0,64 г, таурин - 0,40 г; ряд других солей, вода для инъекций - до 400 мл. Теоретическая осмоляльность - 857 мОсмоль/кг, pH - 5,8. Содержание азота - 12,2 г на 1000 мл.
Растворы Вамин 14 и Амин расфасовывали по 0,5 мл в пробирки типа Эппендорф (Ningho Greetmed Medical Istruments, Китай), хранили при 4-6 оС, использовали однократно.
Оценка влияния композиций аминокислот на рост бактерий St. аureus. Стандартизацию 24-часовой культуры St. aureus АТСС 6538 проводили по оптическому стандарту, концентрацию бактерий доводили до 2,0 - 108 микроорганизмов в 1 мл фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ, рН 7,4; Gibco, США). Методом серийных разведений доводили концентрацию бактерий до 2,0 - 103 и 2,0 - 102 микроорганизмов в 1 мл ФСБ. В лунки 96-луночных круглодонных микропланшетов (Sarstedt, Германия) добавляли исследуемые композиции аминокислот Амин или Вамин 14 в конечных концентрациях 20, 10 и 5 % и равный объем взвеси бактерий. Микроорганизмы инкубировали при 37 оС в течение 4 ч при периодическом помешивании, затем высевали по 50 мкл на сектор чашки Петри и культивировали при 37 оС в течение 16-18 ч. Учет колоний проводили визуально с помощью полуавтоматического счетчика колоний микроорганизмов ColonyStar (Funke Gerber, Германия). Каждый вариант постановки эксперимента ставили в дуплетах. Подсчитывали число колоний (колониеобразующих единиц, КОЕ) в расчете на 50 мкл взвеси бактерий в конечном разведении.
Оценка бактерицидности нейтрофилов периферической крови человека в отношении St. aureus в присутствии композиций аминокислот. Влияние композиций аминокислот на бактерицидную активность нейтрофилов (БАН) оценивали по модифицированному методу R. Peck [12] при соотношении нейтрофилов и бактерий 1 : 10, для чего к 2 мл нейтрофилов (2,0 - 106 клеток в мл) добавляли 2 мл взвеси бактерий St. aureus (2,0 - 107 в мл), ресуспендированных в ФСБ. Второй вариант оценки БАН предполагал использование соотношения нейтрофилов и бактерий, равное 10 : 1, для чего к 2 мл нейтрофилов (2,0 - 106 клеток в мл) добавляли 2 мл взвеси бактерий St. aureus (2,0 - 105 в мл). Смесь клеток с бактериями инкубировали в течение 30-40 мин при температуре 37 оС при помешивании, затем нефагоцитированные бактерии отмывали 6 раз центрифугированием при 350 g в течение 20 мин при 4 оС с помощью ФСБ, содержащего 1 % сыворотки АВ-группы. Осадок клеток, фагоцитировавших бактерии, ресуспендировали в ФСБ до концентрации 2,0 - 106 нейтрофилов в 1 мл.
В лунки микропланшетов с рабочим объемом 200 мкл вносили по 100 мкл разведенных композиций аминокислот (Амин или Вамин 14) в конечной концентрации 20, 10 или 5 %. Взвесь нейтрофилов, фагоцитировавших St. aureus, дополнительно вносили в объеме 100 мкл (100 000 клеток) в каждую лунку. В контрольные лунки вместо композиций аминокислот вносили ФСБ. Все варианты эксперимента ставили в дуплетах. Смесь нейтрофилов с композиций аминокислот инкубировали в течение 4 ч с периодическим помешиванием при температуре 37 оС. После завершения инкубации микропланшетов центрифугировали на центрифуге Rotina 380 R (Hettich, Германия) при 200 g дважды в течение 20 мин при 4 °С для осаждения клеток. Взвесь клеток, фагоцитировавших St. aureus, ресуспендировали в лунке микропланшетов в 200 мкл бидистиллированной воды, затем отбирали по 50 мкл и высевали по секторам чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА), культивировали при 35,0 ± 2,0 °С в течение 16-18 ч. Оценку интенсивности бактериального роста проводили визуально путем подсчета отдельных колоний либо на основании шкалы ++++ при интенсивном бактериальном росте как описано в [14].
Оценка "респираторного взрыва" в нейтрофилах периферической крови человека методом проточной цитометрии. Тест основан на количественном учете нейтрофилов, вырабатывающих АФК и NO, детектируемых по преобразованию нефлуоресцирующего дигидрородамина 123 (DHR 123) в флуоресцирующий зеленым цветом родамин 123. Оценку "окислительного взрыва" выполняли на проточном цитофлуориметре FACSCanto II (Becton Dickinson and Company, США). Для этого в образцы ПК здоровых лиц объемом 100 мкл вносили композиции аминокислот (Амин или Вамин 14) в конечных концентрациях 20, 10 или 5 % и инкубировали в течение 15-30-60 мин при 37 оС при помешивании. Затем дополнительно вносили форбол-12-миристат-13-ацетат (ФMA) в конечной концентрации 500 нг/мл и инкубировали в течение 10 мин при 37 оС. Во все образцы ПК добавляли DHR 123 в конечной концентрации 5 нг/мл и вновь инкубировали в течение 10 мин при 37 оС в темноте [15]. Добавляли лизирующий раствор (10 мин при комнатной температуре в темноте), клетки в образцах ПК дважды отмывали ФСБ при 350 g в течение 5 мин при 4 оС, ресуспендировали в 500 мкл ФСБ. На проточном цитофлуориметре FACSCanto II "респираторный взрыв" в клетках регистрировали по параметрам FSC-H/SSC-H, FSC-A/FSC-H, Hist FITC-H, используя программное обеспечение BD FACSDiva v7.0 (Becton Dickinson and Company, США). Популяции нейтрофилов оценивали после выделения логического гейта в двумерной гистограмме (Dot/Plot) по их линейному (FSC) и боковому (SSC) светорассеиванию (рис. 1). Чистота анализируемых клеток по маркеру CD16 (FcγRIII) составила 97,85-99,60 %, экспрессия CD14 в популяции нейтрофилов - 0,55-7,62 %. Степень функциональной активности ("респираторный взрыв") нейтрофилов оценивали по процентному соотношению клеток, выработавших АФК, а также по средней интенсивности флуоресценции (СИФ), эквивалентной ферментативной активности фагоцитов. Нейтрофилы, активированные ФМА, детектировали по флуоресценции в зеленой части спектра родамина 123, что коррелирует со степенью окисления DHR 123 до родамина 123 и отражает продукцию АФК. Для расчета процентного содержания маркированных клеток в % и значений СИФ (в условных единицах, у.е.) использовали статистический пакет программы FACSDiva v7.0. Накопление событий для анализа - не менее 50 000.
![](https://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_immunology,301,,4,photo7,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Статистическая обработка данных. Полученные данные обрабатывались с использованием пакета статистических программ Statistica v10.0, BIOSTAT и статистического пакета FACSDiva v7.0. Значения показателей приводятся как среднее значение ± стандартное отклонение (m ± SD). За критический уровень статистической значимости принимали 95% вероятность безошибочного прогноза (р < 0,05).
Результаты
Влияние композиций аминокислот на бактерицидную активность нейтрофилов человека in vitro
Как представлено на рис. 2, при инкубации нейтрофилов с бактериями в соотношении 1 : 10 наблюдается сплошной бактериальный рост ("газонная культура") на МПА в присутствии Вамина 14 во всех исследованных концентрациях. В присутствии Амина наблюдается менее интенсивный рост бактерий с отдельно различимыми колониями.
![](https://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_immunology,301,,4,photo2,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Интенсивность образования бактериальных колоний была выше для вариантов нейтрофилов в присутствии композиций аминокислот по сравнению с контролем без аминокислот (ФСБ). Композиция аминокислот Амин по сравнению с Вамин 14 проявляла в прямом тесте оценки БАН несколько меньшую (р > 0,05) рост-стимулирующую активность в отношении St. aureus.
Иную картину мы наблюдали при использовали для оценки БАН соотношения клетки/бактерии, равного 10 : 1. Как представлено на рис. 3, наибольшее количество бактериальных колоний отмечено в контроле (ФСБ) без добавления композиций аминокислот. В присутствии исследованных композиций аминокислот и низкой микробной нагрузки БАН повышалась, что приводило к снижению количества выросших бактериальных колоний. Использование аминокислотной композиции Амин во всех изученных концентрациях (20, 10 или 5 %) при соотношении нейтрофилы/St. aureus 10 : 1 вызывало статистически значимый бактерицидный эффект. В свою очередь, композиция аминокислот Вамин 14, хотя и оказывала в аналогичной постановке бактерицидные свойства, последние проявлялись на уровне тенденции с четко выраженным дозозависимым эффектом.
![](https://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_immunology,301,,4,photo3,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Нами также было изучено прямое действие композиций аминокислот на рост бактерий. Как видно из рис. 4, при посевной концентрации 103 бактерий в 1 мл все образцы композиций аминокислот вызывали 2-кратное увеличение количества колоний по сравнению с контролем без аминокислот (ФСБ). Вамин 14 и, в меньшей степени, Амин, в концентрации 20 % вызывали усиление роста бактерий (р > 0,05) по сравнению с концентрациями 10 или 5 %. При использовании более низкой посевной концентрации St. aureus, соответствующей 102 бактерий в 1 мл, сохранялась такая же тенденция. Во всех случаях Амин и Вамин 14 вызывали увеличение количества бактериальных колоний в 3-4,5 раза. Таким образом, исследуемые композиции аминокислот обладали прямой рост-стимулирующей активностью в отношении St. aureus, которая примерно в равной степени выражена у Вамин 14 и Амин. Полученные результаты указывают на возможность аминокислот, входящих в состав Вамин 14 и ГЛФ Амин, выступать в качестве нутриентов в метаболизме делящихся бактериальных клеток.
![](https://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_immunology,301,,4,photo4,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Влияние композиций аминокислот на активность "респираторного взрыва" в нейтрофилах человека in vitro
Нами сначала было оценено значение времени воздействия ФМА и изучаемых композиций аминокислот на показатели "респираторного взрыва" в нейтрофилах ПК человека. Обнаружена прямая связь между временем инкубации нейтрофилов с ФМА и увеличением показателей продукции АФК (рис. 5). В условиях максимальной активации нейтрофилов (ФМА - 500 нг/мл, 60 мин) количество клеток, вырабатывающих АФК, составило 98,11-99,36 % со значением СИФ 1115-1424 у.е. Дополнительное внесение Амина или Вамина 14 в конечной концентрации 10 % при краткосрочной инкубации (15 мин) не влияло, а при среднесрочной (30 мин) или долгосрочной (60 мин) - несколько увеличивало (р > 0,05) продукцию АФК нейтрофилами.
![](https://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_immunology,301,,4,photo5,00000000,)&hide_Cookie=yes)
В таблице представлены показатели продукции АФК нейтрофилами ПК при дополнительном внесении композиций аминокислот Амин и Вамин 14 в конечной концентрации 10 %. Выявлено, что доля нестимулированных клеток, выделяющих АФК спонтанно в присутствии Амин или Вамин 14, составила 1,95 ± 1,33 и 1,80 ± 1,38 % соответственно, что несколько (р > 0,05) выше аналогичного показателя контрольных клеток (в присутствии ФСБ), без существенных различий величины "респираторного взрыва" (значений СИФ), индуцированного в нейтрофилах композициями аминокислот. В условиях стимуляции нейтрофилов ФМА дополнительное внесение препаратов Амин или Вамин 14 в той же конечной концентрации вызывало статистически значимую стимуляцию АФК по показателю СИФ, но не приводило к увеличению доли активированных клеток по сравнению с контролем. При этом уровни стимуляции продукции АФК клетками под действием ФМА в присутствии Амин или Вамин 14 не различались. Уровень "респираторного взрыва" в нейтрофилах, активированных ФМА, при предварительном внесении Амин или Вамин-14 в концентрации 5 % существенно не отличался от значений, наблюдаемых в присутствии композиций аминокислот в концентрации 10 % (данные не представлены).
![](https://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_immunology,301,,4,photo6,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Преинкубация с Амин или Вамин 14 в концентрации 20 % в течение 30 мин с последующей активацией клеток с помощью ФМА приводила к снижению интенсивности "респираторного взрыва" в нейтрофилах на 10-15 % (n = 4, p = 0,269) по сравнению с концентрацией 10 % композиций аминокислот, что сопровождалось закислением среды культивирования и связано с особенностями метаболизма аминокислот. При этом показатели СИФ, отражающие продукцию АФК нейтрофилами, были несколько выше при использовании композиции аминокислот Амин по сравнению с таковым у Вамин 14 (р > 0,05).
Обсуждение
Нейтрофильные гранулоциты являются основными фагоцитами в организме человека, их антимикробная активность определяется АФК- и NO-зависимыми ферментными системами, антимикробными пептидами [8, 10, 11, 16, 17]. Процесс фагоцитоза является многоэтапным и завершается внутриклеточным (а также внеклеточным) перевариванием микроорганизмов [8, 18-20]. Существуют различные методические подходы для оценки антибактериальной функции нейтрофилов. Одним из наиболее распространенных методов является характеристика "респираторного взрыва" в нейтрофилах, связанного с выделением АФК в ответ на широкий спектр раздражителей [10, 21]. Использование проточной цитометрии для его оценки в автоматическом режиме позволяет провести количественную оценку "респираторного взрыва" в различных клеточных системах in vitro [15, 22]. "Респираторный взрыв" характеризует ранние этапы реакции нейтрофилов на фагоцитоз микроорганизмов, их продуктов, а также других активаторов, в то время как посев на питательные среды нейтрофилов, фагоцитировавших бактерии, характеризует конечный этап фагоцитоза по оценке выживших микроорганизмов [16]. Поэтому нами использовано несколько подходов для оценки функции нейтрофилов при изучении иммуномодулирующих свойств композиций аминокислот. Использование классического метода оценки антибактериальной функции нейтрофилов путем бактериологического посева нейтрофилов, фагоцитировавших St. aureus, при соотношении клетки/бактерии 1 : 10 показало отсутствие видимой способности аминокислот оказывать поддержку клеткам по киллингу бактерий и преимущественно стимулирующую активность аминокислот в отношении роста бактерий на питательных средах. При изменении соотношения клетки/бактерии до 10 : 1, создающего низкую бактериальную нагрузку на нейтрофилы, мы наблюдали обратный эффект: способность добавленных композиций аминокислот преимущественно усиливать антибактериальную активность клеток. Иначе говоря, в условиях невысокой активационной нагрузки композиции аминокислот оказывали иммуномодулирующее действие, стимулируя антибактериальную функцию нейтрофилов. В то же время высокая активационная нагрузка на нейтрофилы (при соотношении клетки/бактерии 1 : 10) не позволяла проявлять стимулирующее/поддерживающее действие нутриентов на клетки, при этом оно сохранялось для выживших бактерий.
Следует отметить, что аналогичная зависимость от степени активации клеток наблюдалась на других моделях. Так, T. Jedrejewski и соавт. [23] отмечали зависимость иммуномодулирующего действия экстракта грибов Coriolus versicolor в отношении индуцированной бактериальным липополисахаридом (ЛПС) продукции интерлейкина-6 (ИЛ-6) и фактора некроза опухолей α (ФНОα) в культуре макрофагов линии RAW 264.7. В присутствии высоких доз ЛПС (500 нг/мл) экстракт грибов вызывал подавление, в то время как при стимуляции макрофагов низкими дозами ЛПС экстракт грибов усиливал продукцию цитокинов. Использованные нами композиции аминокислот Амин и Вамин 14 проявляли аналогичные эффекты в тесте оценки БАН человека. На модели активации "респираторного взрыва" в нейтрофилах, вызванного ФМА, композиции аминокислот Амин или Вамин 14 обладали слабым иммуностимулирующим действием. Хорошо известно, что композиции аминокислот могут обладать иммуномодулирующими свойствами [2, 3, 7]. С использованием разных экспериментальных моделей нами обосновывается двойственное действие композиций аминокислот, связанное с уровнем активации нейтрофилов как основных фагоцитирующих клеток врожденного иммунитета человека.
Заключение
Изучение способности композиций аминокислот Амин и Вамин 14 оказывать иммуномодулирующее действие выявило их слабое стимулирующее действие на "респираторный взрыв" в нейтрофилах, активированных ФМА, что отражает ранние этапы антибактериальной активности клеток. В тесте прямой оценки бактерицидности при соотношении нейтрофилы/бактерии (St. aureus) 1 : 10 композиции аминокислот стимулировали рост выживших фагоцитированных бактерий, в то время как при соотношении нейтрофилы/бактерии 10 : 1 присутствие исследованных композиций аминокислот усиливало БАН, вызывая уменьшение количества выживших бактерий, формирующих колонии на плотных питательных средах. Предварительная инкубация бактерий с Амин или Вамин 14 приводила к усилению роста бактерий. Таким образом, иммуномодулирующее действие композиций аминокислот Амин или Вамин 14 проявляется как стимуляция антибактериальной функции нейтрофилов при низком соотношении бактерий и клеток либо стимуляция преимущественно роста бактерий при высоком соотношении бактерий и клеток. Использование нескольких подходов для оценки антибактериальной функции нейтрофилов (оценка "респираторного взрыва", прямая бактерицидная активность, прямое действие на рост бактерий) а также различная по дозе бактериальная нагрузка позволили нам охарактеризовать различия в механизмах действия композиций аминокислот на разные этапы фагоцитоза.
Литература
1. Miyajima M. Amino acids: Key sources for immunometabolites and immunotransmitters. Int. Immunol. 2020; 32 (7): 435-46. DOI: https://doi.org/10.1093/intimm/dxaa019
2. Hung K.Y., Chen Y.M., Wang C.C., Wang Y.H., Lin C.Y., Chang Y.T., Huang K.T., Lin M.C., Fang W.F. Insufficient nutrition and mortality risk in septic patients admitted to ICU with the focus on immune dysfunction. Nutrients. 2019; 11: 367-77. DOI: https://doi.org/10.3390/nu11020367
3. Bonvini A., Coqueiro A.Y., Tirapegui J., Calder P.C., Rogero M.M. Immunoregulatory role of branched-chain amino acids. Nutr. Rev. 2018; 76: 840-56. DOI: https://doi.org/10.1093/nutrit/nuy037
4. Zhenyukh O., Civantos E., Ruiz-Ortega M., Sanchez M.S., Vasquez C., Peiro C., Egido J., Mas S. High concentration of branched-chain amino acid promotes oxidative stress, inflammation and migration of human peripheral blood mononuclear cells via mTORS1 activation. Free Radic. Biol. Med. 2017; 104: 165-77. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2017.01.009
5. De Oliveira D.C., da Silva Lima F., Sartori T., Santos A.C.A., Rogero M.M., Fock R.A. Glutamine metabolism and its effects on immune response: molecular mechanism and gene expression. Nutrire. 2016; 41: 14-24. DOI: https://doi.org/10.1186/s41110-016-0016-8
6. Tome D. Amino acid metabolism and signaling pathways: Potential targets in the control of infection and immunity. Eur. J. Clin. Nutr. 2021; 75: 1319-27. DOI: https://doi.org/10.1038/s41430-021-00943-0
7. Kelly B., Pearce E.L. Amino assets: How amino acids support immunity. Cell Metab. 2020; 32: 1-22. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.06.010
8. Печковский Д.В., Потапнев М.П. Механизмы фагоцитоза и бактерицидности нейтрофилов человека. Здравоохранение Беларуси. 1994; (6): 39-44.
9. De Oliveira-Junior E.B., Bustamante J., Newburger P.E., Condino-Neto A. The human NADPH oxidase: primary and secondary defects impairing the respiratory burst function and microbicidal ability of phagocytes. Scand. J. Immunol. 2011; 73: 420-7. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-3083.2010.02501.x
10. El-Benna, Hurtado-Nedelec M., Marzaioli V., Marie J.C., Gougerot-Pocidalo M.A., Dang P.M.C. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunol. Rev. 2016; 273: 180-93. DOI: https://doi.org/10.1111/imr.12447
11. Thomas D.C. The phagocyte respiratory burst: historical perspectives and recent advances. Immunol. Lett. 2017; 192: 88-96. http://dx.doi.org/10.1016/j.imlet.2017.08.016
12. Peck R. A one-plate assay for macrophage bactericidal activity. J. Immunol. Methods. 1985; 82 (1): 131-40. DOI: https://doi.org/10.1016/0022-1759(85)90232-7.
13. Hallgren R., Stalenheim G. Quantification of phagocytosis by human neutrophils. The use of radiolabelled staphylococcal protein A-IgG complexes. Immunology. 1976; 30: 755-62.
14. Самотруева М.А., Озеров А.А., Старикова А.А., Габитова Н.М. Мережкина Д.В., Цибизова А.А., Тюренков И.Н. Изучение антимикробной активности новых хиназолин-4(3Н)-онов по отношению к Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumonia. Фармация и фармакология. 2021; 9 (4): 318-29.
15. Rothe G., Emmendorffer A., Oser A., Roesler J., Valet G. Flow cytometric measurement of the respiratory burst activity of phagocytes using dihydrorhodamine 123. J. Immunol. Methods. 1991; 138: 133-5. DOI: https://doi.org/10.1016/0022-1759(91)90074-p
16. Hampton M.B., Kettle A.J., Winterbourn C.C. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood 1998; 92 (9): 3007-17. PMID: 9787133.
17. Потапнев М.П., Гущина Л.М., Мороз Л.А. Фенотипическая и функциональная гетерогенность нейтрофилов в норме и при патологии. Иммунология. 2019; 40 (5): 84-96. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-15009
18. Pechkovsky D. V., Potapnev M.P., Zalutskaya O.M. Different patterns of cytokine regulation of phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils. Int. J. Antimicrоb. Agents. 1996; 7 (1): 33-40. DOI: https://doi.org/10.1016/0924-8579(96)00007-6
19. Долгушин И.И., Мезенцева Е.А., Савочкина А.Ю., Кузнецова Е.К. Нейтрофил как "многофункциональное устройство" иммунной системы. Инфекция и иммунитет. 2019; 9 (1): 9-38. DOI: http://dx.doi.org/10.15789/2220-7619-2019-1-9-38
20. Ley K., Hoffman H.M., Kubes P., Cassatella M., Zyclinsky A., Hedrick C.C. Catz S.D. Neutrophils: new insights and open questions. Sci. Immunol. Rev. 2018; 3: eaat4579. DOI: https://doi.org/10.1126/sciimmunol.aat4579
21. Мухин В.Е., Панкратьева Л.Л., Милева О.И., Ярцев М.Н., Володин Н.Н. Значение морфологических и функциональных особенностей нейтрофилов недоношенных новорожденных в развитии неонатальных инфекций. Иммунология. 2021; 42 (2): 140-7. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-2-140-147
22. Савченко А.А., Кудрявцев И.В., Борисов А.Г. Методы оценки и роль респираторного взрыва в патогенезе инфекционно-воспалительных заболеваний. Инфекция и иммунитет. 2017; 7 (4): 327-40. DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-2027-4-327-340
23. Jedrzejewski T., Sobocinska J., Pawlinkowska M., Dzialuk A., Wrotek S. Dual effect of the extract from fungus Coriolus versicolor on lipopolysaccharide-induced cytokine production in RAW 264.7 macrophages depending on the lipopolysaccharide concentration. J. Inflamm. Res. 2022; 15: 3599-611. DOI: https://doi.org/10.2147/jir.s364945