Перспектива использования рекомбинантных белков M. leprae в серодиагностике лепры

• Королёва-Ушакова Анжела Григорьевна
• Панфёрцев Евгений Александрович
• Баранова Евгения Владимировна
• Шевяков Антон Георгиевич
• Горбатов Алексей Александрович
• Игнатов Сергей Георгиевич
• Бикетов Сергей Федорович

Резюме

Введение. Лепра - хроническое гранулематозное заболевание, вызываемое Mycobacterium leprae (M. leprae), поражающее производные эктодермы (в первую очередь периферические нервы и кожу), часто приводящее к инвалидизации. Важнейшим инструментом лабораторного контроля лепры является иммунодиагностика. С использованием биоинформатики и сравнительной геномики были идентифицированы и клонированы гены, кодирующие уникальные для возбудителя лепры и потенциально наиболее иммуногенные белки. Было сделано предположение, что рекомбинантные антигены-кандидаты, уникальные для M. leprae, такие как ML0050 и ML0576, могут служить мишенями для оценки специфического клеточного и гуморального иммунитета к M. leprae.

В данной работе мы поставили цель получить конъюгированные с БСА рекомбинантные антигены M. leprae ML0050, ML0576, слитый рекомбинантный белок ML0050-ML0576 и оценить их диагностический потенциал для серологической диагностики лепры при определении IgG-, IgM- и IgA-антител человека к данным антигенам.

Материал и методы. В работе использовали молекулярно-генетические и иммунобиохимические методы. Материалом для исследований послужили сыворотки крови больных лепрой и туберкулезом, а также сыворотки крови здоровых доноров. В работе суммарно определяли IgG-, IgM- и IgA-антитела человека против антигенов M. leprae.

Результаты. Полученные нами рекомбинантные антигены M. leprae ML0050 и ML0576 и слитый рекомбинантный белок ML0050-ML0576, конъюгированные с бычьим сывороточным альбумином, оценены при определении IgG-, IgM- и IgA-антител человека против антигенов M. leprae с помощью иммуноферментного и иммунохроматографического анализа с сыворотками крови от 15 больных лепрой, 25 больных туберкулезом и 30 здоровых доноров.

Заключение. Полученные результаты показали возможность использования полученных рекомбинантных белков в качестве антигенов для серологической диагностики лепры.

Ключевые слова:иммуноферментный анализ; иммунохроматографический анализ; лепра; M. leprae; ML0050-БСА; ML0576-БСА; ML0050-ML0576-БСА; рекомбинантные антигены; серологическая иммунодиагностика

Введение

Лепра - хроническое гранулематозное заболевание, вызываемое Mycobacterium leprae (M. leprae), поражающее производные эктодермы (в первую очередь периферические нервы и кожу), часто приводящее к инвалидизации [1].

Существует несколько признанных классификационных форм лепры. Сложность и полярность иммунопатогенетических форм лепры диктует необходимость комплексного подхода к диагностике этого заболевания и включает клинические, бактериологические, патогистологические и лабораторные методы. Важнейшим инструментом лабораторного контроля лепры является иммунодиагностика [2, 3].

Было установлено, что антитела к различным антигенам M. leprae могут служить маркерами регресса или активации лепрозного процесса у больных, получающих специфическое лечение. Динамика уровня антител к антигенам M. leprae позволяет оценить эффективность химиотерапии, выявить группу риска по развитию рецидива и наличию очагов персистенции. Показано, что биомаркерами лепры могут быть специфические антигены, антитела, их определенные комбинации или сенсибилизированные клетки иммунной системы [4, 5]. Исследователями было выделено и охарактеризовано множество секреторных, мембранных и клеточных антигенов, включая основные мембранные и секреторные белки, белки теплового шока, полисахаридные и гликолипидные молекулы [6-8]. Однако серологические тесты на основе большинства исследованных антигенов демонстрировали недостаточную чувствительность, особенно при малобактериальной форме.

Когда в 2001 г. был полностью секвенирован геном M. leprae [9], работы по иммунодиагностике лепры получили второе дыхание. Информация о последовательностях генов, кодирующих секреторные и поверхностные белки, дала возможность получить десятки рекомбинантных антигенов возбудителя лепры. С использованием биоинформатики и сравнительной геномики были идентифицированы и клонированы гены, кодирующие уникальные для возбудителя лепры и, потенциально, наиболее иммуногенные белки [10].

Поскольку выделить микобактериальные антигены из самих возбудителей чрезвычайно сложно, в последние десятилетия с помощью технологий рекомбинантных ДНК было получено и использовано в качестве антигенов в серологических тестах много уникальных рекомбинантных белков Mycobacterium leprae, а также белков, имеющих гомологию с Mycobacterium tuberculosis [11].

В данной работе мы поставили цель получить рекомбинантные антигены M. leprae ML0050, ML0576, слитый рекомбинантный белок ML0050-ML0576 и оценить их диагностический потенциал для серологической диагностики лепры.

Материал и методы

Объект исследования. Для проведения иммуноферментного и иммунохроматографического (ИХ) анализов использовали образцы 15 сывороток крови больных лепрой из коллекции НИИ лепры (г. Астрахань), 25 сывороток крови больных туберкулезом, а также 30 сывороток крови здоровых доноров (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, Оболенск). Для исключения ложноположительных результатов исследуемые сыворотки крови готовили и хранили в стерильных условиях, исключающих возможность бактериального загрязнения. Сыворотки крови с выраженным гемолизом, гиперлипидемией и бактериемией отбраковывались. Пул, содержащий несколько образцов сывороток крови, а также сыворотки крови с повторным циклом замораживания-оттаивания к тестированию не допускались. Каждый образец сыворотки крови или раствора отбирали новым наконечником.

В работе применяли иммунобиохимические и молекулярно-генетические методы исследования. Работы проводились на базе ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, Оболенск.

Молекулярно-генетические методы. ПЦР-амплификация и клонирование генов M. leprae ml0050 и ml0576. Для конструирования рекомбинантных иммунодоминантных антигенов M. leprae ML0050, ML0576 и слитого рекомбинантного белка ML0050-ML0576 использовали ПЦР-амплификацию генов, кодирующих вышеуказанные антигены с их последующим клонированием в составе векторной ДНК pET32(b). Дизайн праймеров для амплификации и клонирования генов M. leprae ml0050 и ml0576 и генетической конструкции слитого белка ML0050-ML0576 осуществляли с использованием информационного ресурса NCBI и пакета программ LaserGene. Олигонуклеотиды разрабатывали таким образом, чтобы клонировать в экспрессирующем векторе pET32(b) только структурные части генов, кодирующие зрелые белки, и слить клонируемые белки с полигистидиновым доменом, который позволяет проводить одностадийную очистку исследуемого белка на металлохелатном сорбенте.

Условия реакции. Режим ПЦР: 95 °С/30 с. 50 °С/30 с. 72 °С/30 с/35 циклов. Последняя стадия элонгации - мин. Реакция протекала в 50 мМ KCl-буфере в присутствии 1,5 мМ MgCl₂ (Sigma-Aldrich, США), 7 % DMSO (Sigma-Aldrich, США), 0,2 мМ dNTP (Sigma-Aldrich, США) и 10 пМ каждого праймера. В качестве матрицы использовали ДНК, выделенную из соскоба кожи больного лепрой (ФГБУ "НИИЛ" Минздрава России, Астрахань). Использовали Taq-полимеразу и реактивы производства "Thermo Fisher Scientific Inc." (США). Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 1,0 % агарозном геле в присутствие EtBr (Sigma - Aldrich, США).

ПЦР-фрагменты очищали при помощи набора "DNA Extraction Kit" (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Далее ДНК лигировали с вектором pGEMteasy (Promega, США) в течение 2 ч при 37 °С. Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli DH5α. Отбор трансформантов проводили на плотной питательной среде LA (VWR Amresco Life Science, США) содержащей 100 мкг/мл ампициллина, X-gal and 1 mM IPTG (Sigma-Aldrich, США).

Скрининг рекомбинантных плазмид, содержащих гены M. leprae, осуществляли с использованием ПЦР. В качестве олигонуклеотидов использовали M13 прямой и обратный праймеры, комплементарные областям векторной плазмиды pGEMteasy (табл. 1).

В результате были отобраны клоны E. coli, содержащие рекомбинантные плазмиды pGEMteasyMLs. Секвенирование рекомбинантных плазмид проводили по стандартной методике с использованием системы CEQ^Tm 2000 XLDNA Analysis System (Beckman Coulter, США). В качестве олигонуклеотидов использовали M13 прямой и обратный праймеры, комплементарные областям векторной плазмиды pGEMteasy.

Гены M. leprae ml0050 и ml0576 были переклонированы в NdeI + XhoI-сайты экспрессирующего вектора pET32(b) под контролем Т7-промотора стандартным рестриктазно-лигазным методом. Для получения гибридного белка ML0050-ML0576 в XhoI-сайт плазмиды pETMl0050 путем ПЦР был клонирован XhoI-фрагмент, кодирующий синтез белка ML0576. Ориентацию XhoI-XhoI-фрагмента гена ml0576 проводили с помощью рестрикционного картирования с последующим секвенированием рекомбинантной плазмиды с Т7-праймерами, комплементарными промоторной и терминаторной областям плазмиды pET32(b). Рекомбинантными плазмидами pETMl0050, pETMl0576 и pETMl0050-Ml0576 трансформировали компетентные клетки E. coli Bl21RP (Novagen, США) для получения штаммов-продуцентов.

Изучение экспрессии клонированных генов в клетках штаммов-продуцентов E. coli. Ночную бактериальную культуру рекомбинантных штаммов-продуцентов E. coli Bl21RP/pETMl0050, Bl21RP/pETMl0576 и Bl21RP/pETMl0050-Ml0576 разводили свежим LB-бульоном (VWR Amresco Life Science, США) (1 : 10 в объеме 1 мл) с ампициллином (VWR Amresco Life Science, США) (50 мг/л) и подращивали 2 ч при температуре 37 °С на качалке (200 об/мин). Затем добавляли IPTG (Sigma-Aldrich, США) до концентрации 1 мM. Клетки растили еще 4 ч в аналогичных условиях. Выросшую культуру центрифугировали, осадок ресуспендировали в 300 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (ПанЭко, Россия) и добавляли 300 мкл 2х буфера [65,8 мM Трис-HCl, pH 6,8, 2,1 % SDS, 26,3 % (вес/объем) глицерина, 0,01 % бромфенолового синего (Sigma-Aldrich, США)]. Пробы кипятили 5 мин, центрифугировали в течение 5 мин при 10000 g и анализировали в ПААГ-электрофорезе. Белковый электрофорез проводили в 13 % ПААГ с добавлением SDS (Helikon, Россия) в буферной системе Laemmly [12]. Гели окрашивали Coomassie brilliant blue R-250 (Sigma-Aldrich, США), для постановки иммуноблота использовали неокрашенные гели. Вестерн-блоттинг проводили по методу Towbin, 1979 [13] c использованием моноклональных антител к полигистидиновому домену, меченных пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich, США). Определение количества белка проводили по стандартному методу Lowry [14] с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Очистка рекомбинантных белков M. leprae ML0050, ML0576 и ML005-ML0576. Биомассу рекомбинантных штаммов-продуцентов E. coli Bl21RP/pETMl0050 и Bl21RP/pETMl0576 из 1 л индуцированной культуры осаждали центрифугированием при 6000 g в течение 15 мин (Beckman G2-21, ротор JA-10, (Beckman Coulter, США). Биомассу дважды отмывали центрифугированием в ФСБ и ресуспендировали в 20-кратном объеме связывающего буфера (5 мМ имидазол (Sigma-Aldrich, США), 6 М мочевина, 500 мМ NaCl, 20 мМ Трис-НCl, рН 7,9 (Sigma-Aldrich, США) с добавлением 1 мМ PMSF (Sigma-Aldrich, США). Дезинтеграцию микробных клеток проводили 10 циклами озвучивания, импульсами 30 с, с перерывом 30 с на ледяной бане Virsonic 100 (Virtis, США). Клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 15 000 g в течение 20 мин (Beckman G2-21, ротор JA-20, США). Супернатант использовали для выделения целевого белка аффинной хроматографией на Chelating Sepharose 6B (Sigma-Aldrich, США). Сорбент осторожно ресуспендировали в деионизованной воде и вносили равномерным потоком в колонку (1×10 см), объем геля составил 5-6 мл. Сорбент активировали 10 объемами 50 мМ NiSO₄ (Sigma-Aldrich, США) в деионизованной воде. После промывки деионизованной водой (3 объема) колонку уравновешивали связывающим буфером (20 мМ Трис-НCl, 5 мМ имидазол, 6 М мочевина, 0,5 М NaCl, рН 7,9 (Sigma-Aldrich, США) и выдерживали при 4 °С 30 мин. Препарат наносили на колонку со скоростью не более 1 мл/мин во избежание проскока очищаемого белка. После промывки колонки связывающим буфером (10 объемов) проводили ступенчатую элюцию рекомбинантного белка под контролем спектрофотометра (λ = 280 нм): 1-я ступень - элюция 60 мМ имидазола + связывающий буфер; 2-я ступень - элюция связывающим буфером с 500 мМ имидазола. Фракции, содержащие целевой белок, диализовали в течение 12 ч против ФСБ. Концентрацию очищенного белка в препарате определяли по методу Lowry-Folin. Препарат хранили при -70 °С.

Конъюгация рекомбинантных белков ML0050 и ML0576 с бычьим сывороточным альбумином (БСА). В качестве блокирующего агента или инертного носителя углеводных и протеиновых антигенов часто используется БСА. Использование блокирующего агента, такого как БСА, предотвращает неспецифическое связывание антител в иммуноферментном анализе (ИФА) с микропространствами на поверхности микропластинки, не занятой специфическим антигеном. Также БСА используется в качестве носителя непротеиновых антигенов в композициях иммуноанализа. Конъюгацию рекомбинантных белков с БСА (AppliChem, Германия) проводили с помощью диэтилового эфира скваратной кислоты (диэтилскварата) по стандартной методике. Конъюгаты были очищены с помощью хроматографии на колонке TSK HW-40S (Toyopeаrl, Япония) [15-17].

Синтез коллоидного золота (КЗ) проводили по методу G. Frens [18], восстанавливая цитратом натрия (AppliChem, Германия) из золотохлороводородной кислоты (Sigma-Aldrich, США). К 48,5 мл деионизованной воды (18,2 Мом) добавляли при постоянном перемешивании 150 мкл 10 % раствора золотохлороводородной кислоты. Смесь доводили до кипения и добавляли 1,5 мл 1 % раствора цитрата натрия. Смесь продолжали кипятить с перемешиванием 25 мин до появления устойчивой рубиново-красной окраски. Полученную суспензию КЗ охлаждали до комнатной температуры и хранили при температуре 4-6 С. Оптическую плотность раствора КЗ определяли спектрофотометрически (DeNovix, США).

Получение конъюгата коллоидного золота с козьими антителами против человеческих Ig (IgG, IgA, IgM). Определение флокуляционных кривых проводили по G.T. Hermanson [19]. Раствор козьих антител против человеческих Ig (A, G, M) ("Goat Anti-Human IgA, IgG, IgМ", Sigma, США) диализовали против 10 мМ Трис-НCl (AppliChem, Германия) с pH 9,0 и готовили серию разведений с концентрациями 5-500 мкг/мл. К раствору КЗ с ОП₅₂₀ (оптическая плотность) = 1,0 по каплям добавляли 0,2 М карбонат натрия (Sigma-Aldrich, США), доводя pH до 9,0. К 0,1 мл раствора козьих антител добавляли 1,0 мл раствора КЗ с pH 9,0, перемешивали и инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Затем к растворам конъюгатов КЗ с козьими антителами добавляли по 0,1 мл 10 % раствора хлорида натрия (AppliChem, Германия) и через 10 мин спектрофотометрически определяли поглощение раствора при ОП₅₈₀. Для приготовления конъюгата использовали наименьшую концентрацию козьих антител, при которой ОП₅₈₀ оставалось на уровне плато в расчете на 1 мл раствора КЗ с ОП₅₂₀ = 1,0. Концентрации козьих антител, соответствующие точкам выхода флокуляционных кривых на плато, составили 6,5 мкг/мл. Для конъюгации с КЗ была выбрана концентрация козьих антител, на 15 % превосходящая точку выхода ОП₅₈₀ на плато, как рекомендовано [19], т.е. 7,48 мкг/мл. Раствор козьих антител диализовали против 1000-кратного объема 10 мМ Трис-HCl с pH 9,0 в течение 2 час при 4 С. Полученный раствор центрифугировали при 10 000 g в течение 30 мин. Супернатант, содержащий козьи антитела против человеческих Ig (A, G, M), использовали для приготовления конъюгата КЗ. В раствор КЗ ОП₅₂₀ = 1,0 с pH 9,0 вносили рассчитанное количество козьих антител, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем к раствору добавляли водный раствор БСА до конечной концентрации 0,2 %, инкубировали в течение 15 мин. Полученный конъюгат центрифугировали при 9000 g в течение 30 мин. Супернатант полностью отбирали, осевшие частицы ресуспендировали в 20 мМ Трис-HCl с добавлением 1,0 % БСА, 1,0 % сахарозы (Sigma-Aldrich, США), 0,1 % Tween-20 (AppliChem, Германия), 0,1 % азида натрия (Sigma-Aldrich, БСА). Препарат конъюгата КЗ с козьими антителами против человеческих Ig (A, G, M) хранили при 4-6 С.

Проведение ИФА. Рекомбинантные антигены разводили до 0,5 мг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6) (ПанЭко, Россия) и 0,1 мл разбавленного антигена добавляли в лунки 96-луночного планшета (Nunc, MaxiSorp, Дания) и выдерживали в течение ночи при 4 °С. Далее промывали планшет фосфатным буфером с Твином (ФСБ-Т) 2 раза. Вносили в каждую лунку планшета 0,2 мл блокирующего реагента (5 % обезжиренное сухое молоко) и инкубировали в течение часа при 37 °С. Промывали планшет ФСБ-Т 2 раза. Вносили в лунки планшета сыворотки крови, разведенные 1 : 200, и инкубировали 1 ч при 37 °С. В лунку планшета А1 вносили 0,1 мл рабочего буферного раствора (РБР, используется как бланк). В лунки В1, С1 вносили отрицательную контрольную сыворотку крови в рабочем разведении (К-) объемом 0,1 мл, в лунки D1, D2 вносили положительную контрольную сыворотку крови в рабочем разведении (К+) объемом 0,1 мл. В остальные лунки планшета вносили по 0,1 мл исследуемых сывороток крови в рабочем разведении. Инкубировали на шейкере 1 ч при 37 °С. Промывали планшет ФСБ-Т 3 раза. Вносили в лунки планшета по 0,1 мл рабочего разведения пероксидазного конъюгата кроличьих антител против человеческих Ig (A, G, M) (Sigma, США) и инкубировали в течение 1 ч при 37 °С. Промывали планшет ФСБ-Т 4 раза. Вносили в лунки планшета по 0,1 мл свежеприготовленного субстратного раствора (двухкомпонентная хромогенная система тетраметилбензидин - субстратный буфер в соотношении 1 : 1). Планшет помещали на 15 мин в защищенное от света место. Ферментативную реакцию останавливали после развития окраски добавлением 0,05 мл 1 М Н₂SО₄ (ДиаМ, Россия). Регистрировали оптическую плотность раствора при l = 450 нм с помощью планшетного фотометра Униплан (Пикон, Россия). Нулевой уровень (бланк) устанавливали по лунке А1.

Изготовление иммунохроматографических тест-полосок. На нитроцеллюлозные мембраны пористостью 10 мкм (TYPE-CNРF-SN12-L2-P25, MDI, Индия) при помощи диспенсера IsoFlow (Imagene Technology, США) наносили растворы антигенов ML0576-БСА, ML0050-БСА, ML0050-ML0576-БСА в концентрации 0,5 мг/мл для формирования тестовой зоны и кроличьих антител против иммуноглобулинов козы в той же концентрации для формирования контрольной зоны. В качестве стабилизирующих реагентов использовали 20 % глицерин, 1 % БСА, 0,01 % азид натрия. Раствор конъюгата коллоидного золота с козьими антителами против человеческих Ig наносили на стекловолоконные фильтры (TYPE-PT-R5, MDI, Индия) со скоростью 8 мм/с в объеме 1,6 мкл/мм. Затем фильтры высушивали в течение 1 сут при комнатной температуре. На мембраны после формирования тестовой и контрольной зон подклеивали фильтры с конъюгатом коллоидного золота. Также на нитроцеллюлозную мембрану со стороны фильтра с конъюгатом коллоидного золота подклеивали подушечку для образца TYPE-CFB-R7L (0,6) (MDI, Индия), а на другую сторону нитроцеллюлозной мембраны - поглощающую подушечку TYPE-AP 045 (MDI, Индия). Далее полученный мультимембранный композит подсушивали в течение 2 ч при 25 % влажности воздуха и температуре 25 °С в климатической камере (Memmert, Германия). Нарезку мультимембранного композита на полоски шириной 0,5 см проводили при помощи автоматического гильотинного ножа Index Cutter-1 (A-Point Technologies, США).

Принцип работы экспресс-теста для ускоренной серодиагностики лепры. Экспресс-тест сконструирован в формате deep-stick (погружаемый тест). На первой стадии анализа происходит взаимодействие конъюгата КЗ-козьи антитела против человеческих Ig (A, G, M) с антителами в исследуемой пробе сыворотки крови пациента. Затем фронт жидкости с образовавшимся иммунным комплексом (конъюгат КЗ-козьи антитела связавшийся с антителами человека) под действием капиллярных сил последовательно мигрирует через аналитическую зону, которая представляет собой участок мембраны с иммобилизованным антигеном M. leprae, и контрольную зону с иммобилизованными кроличьими антителами против козьих антител. Иммунный комплекс связывается с аналитической зоной теста при условии наличия в исследуемой пробе сыворотки крови специфических антител к M. leprae. В результате данного взаимодействия образуется окрашенный иммунопреципитат. Окрашивание контрольной зоны происходит за счет связывания конъюгата КЗ с козьими анитителами, независимо от наличия в исследуемой пробе сыворотки крови антител, специфических к M. leprae.

Проведение ИХА. Оценку рабочих характеристик ИХ-тестов для ускоренной серодиагностики лепры проводили в трех повторах. Анализ проводили в трех повторах. Необходимое количество тестов, хранившихся при +4 °С, выдерживали при комнатной температуре 15 мин. Сыворотку крови перед исследованием размораживали при комнатной температуре, разводили в 10 раз в 0,1 мл ФСБ и вносили в лунку 96-луночного планшета. Затем туда же вертикально погружали ИХ-тест и инкубировали в течение 15 мин. После чего тест извлекали, помещали на горизонтальную поверхность и проводили визуальный учет результатов.

Результаты

Молекулярно-генетическими и биохимическими методами были получены кандидатные рекомбинантные белки и их конъюгаты с БСА. Данные белки исследованы на пригодность для серодиагностики лепры в качестве антигенов в ИФА и ИХА с сыворотками крови пациентов. Для обработки и анализа полученных данных использовали программу Statistica 10 (StatSoft, США). Качество реакции считалось достоверным при оптической плотности (ОП) в лунках с К- среднее значение ОП (ОП К_ср-) ≤ 0,2 о.е., а в лунке с К+ значение ОП (OП К_ср+) ≥ 0,8 о.е. Результаты анализа оценивали по коэффициенту серопозитивности (КС), рассчитываемому по формуле: КС = ОП образца / ОП крит, где ОП крит = ОП К_ср- + 0,2. Оценку результатов производили по следующим показателям:

· КС < 0,8 - тестируемый образец не содержит антител к возбудителю лепры;

· 0,8 < КС < 1,0 - сомнительный;

· КС > 1,0 - положительный.

Диагностическую специфичность рассчитывали как отношение числа истинно отрицательных результатов к сумме истинно отрицательных и ложноположительных результатов, выраженное в процентах. Диагностическую чувствительность определяли как отношение числа истинно положительных результатов к сумме истинно положительных и ложноотрицательных результатов, выраженное в процентах. Ошибку выборочной доли диагностической чувствительности и специфичности рассчитывали с вероятностью р = 0,95 и критерием достоверности t ≥ t_st.

Результаты ИХА оценивали визуально. Наличие одной полосы в области контрольной зоны фиксировали как отрицательный результат; двух полос в области тестовой и контрольной зон - как положительный. Результаты ИФА и ИХА с использованием рекомбинантных белковых антигенов представлены в табл. 2 и 3.

При анализе серологической активности рекомбинантных антигенов в ИФА с 15 сыворотками крови от больных лепрой пациентов, 30 сыворотками крови от здоровых доноров, 25 сыворотками крови от больных туберкулезом показан различный уровень специфичности и чувствительности. Так, модифицированный антиген ML0050-ML0576-БСА обладал наибольшей чувствительностью в ИФА (табл. 2) по отношению к сывороткам крови больных лепрой: из 15 сывороток крови 9 дали положительный результат, что составило 60 % от общего числа положительных на лепру сывороток крови. Наименьшую диагностическую чувствительность в данной выборке показал антиген ML0050-БСА: из 15 положительных по лепре сывороток крови только 7 дали положительный результат, что составило 46,6 %. Наименьшую перекрестную активность с сыворотками крови больных туберкулезом в ИФА показал слитый белок ML0050-ML0576-БСА. Так, из 25 положительных по туберкулезу сывороток крови 4 дали положительный результат, что в процентном соотношении составило 16 %. Использование в ИФА в качестве антигена ML0050-БСА показало, что из 25 положительных по туберкулезу сывороток крови 8 дали положительный результат. Использование в ИФА в качестве антигена ML0576-БСА показало, что из 25 сывороток крови 5 дали положительный результат, и в процентном соотношении от общего числа положительных по туберкулезу сывороток крови составили 32 и 20 % соответственно. Достаточно высокую специфичность с сыворотками крови здоровых доноров показал антиген ML0050-ML0576-БСА: из 30 сывороток крови здоровых доноров - 21 (70 %) показала отрицательный результат. Белки ML0050-БСА (из 30 сывороток крови 15 показали отрицательный результат в ИФА) и ML0576-БСА (20 из 30 сывороток крови здоровых доноров показали отрицательный результат в ИФА), обеспечили специфичность методу в 50 % и 66,6 % соответственно.

В ИХА, как видно из табл. 3, наилучшую чувствительность к сывороткам крови больных лепрой показал слитный белок ML0050-ML0576-БСА: из 15 сывороток крови от пациентов, больных лепрой, 8 (60%) дали положительный результат, в то время как белки ML0050-БСА (из 15 сывороток крови только 6 дали положительный результат, а ML0576-БСА (из 15 сывороток крови 7 дали положительный результат) обеспечили чувствительность метода в 46,6 и 53,3 % соответственно. Высокую специфичность к сывороткам крови здоровых доноров показал также слитый антиген ML0050-ML0576-БСА: из 30 сывороток крови здоровых доноров 18 показали отрицательный ответ, что обеспечило специфичность метода в 70 %; антигены ML0050-БСА (из 30 сывороток крови 14 дали отрицательный результат) и ML0576-БСА (из 30 сывороток крови 17 показали отрицательный результат), что обеспечивает специфичность метода в 50 и 66,6 % соответственно. Наименьшую перекрестную реактивность в ИХА показал модифицированный антиген ML0050-ML0576-БСА: из 25 сывороток крови 4 дали положительный результат, что составляет 16 % от общего числа сывороток крови положительных по туберкулезу, в то время как антигены ML0050-БСА (из 25 сывороток крови 7 дали положительный результат) и ML0576-БСА (из 25 сывороток крови 5 дали положительный результат) обладали перекрестной реактивностью в 28 и 20 % соответственно. Неспецифическое взаимодействие сывороток крови в ИФА и ИХА с БСА отсутствовало.

Обсуждение

В условиях, когда натуральные антигены M. leprae недоступны в силу того, что культивирование возбудителя лепры на искусственных питательных средах практически невозможно, так как на них она не дает роста, а при развитии в восприимчивом организме растет очень длительно, актуальной задачей развития серодиагностики лепры становится поиск новых искусственных антигенов, которые смогут обеспечить высокую специфичность и чувствительность серологических тестов, необходимую для применения их в качестве компонентов для серодиагностики лепры как дополнительного метода обследования населения [7]. Показано, что при лепре гуморальный иммунный ответ в основном направлен на родо- и видоспецифические антигены, такие как липоарабиноманнан (ЛАМ) и фенольный гликолипид (ФГЛ-1) [5]. Целые молекулы этих антигенов дороги в получении и склонны к неспецифическому взаимодействию, поэтому в серологии используют отдельные эпитопы, которые частично или полностью синтезируют химически. В серодиагностике лепры достаточно давно используют конъюгаты полусинтетического или синтетического аналогов специфического углеводного эпитопа из ФГЛ-1 с БСА [17].

Недостатком подобных тест-систем, использующих в качестве антигена аналоги углеводного эпитопа из ФГЛ-1, является выявление антител лишь к одному эпитопу, в то время как гуморальный иммунный ответ при лепре направлен против нескольких антигенов. Перспективные подходы для объединения нужных эпитопов из различных антигенов - получение химерных белков, кодируемых слитыми генами, а также химическая конъюгация белков с углеводными молекулами. Поэтому для серодиагностики различных форм лепры используют разные микобактериальные антигены на основе углеводных эпитопов, полученные методом химического синтеза, такие как ФГЛ-1, ЛАМ, синтетический дисахарид ФГЛ-1 (ND-O-BSA), или путем генетического слияния рекомбинантных лепрозных белковых антигенов [8, 16, 17].

Перспективы улучшения серодиагностики лепры, по мнению большинства исследователей, связаны с использованием различных комбинаций новых специфических антигенов.

Большая часть вреда человеческому организму наносится не самим инфекционным агентом, а скорее иммунными реакциями хозяина на этот микроорганизм.

На данный момент в мире существует несколько антигенных компонентов M. leprae, рекомендованных Всемирной организацией здравоохранения для использования в целях серодиагностики. Это следующие антигены: природный ФГЛ-1, ND-О - полусинтетический дисахарид (ND), присоединенный к октиловому радикалу (O), который является аналогом ФГЛ-1, а также белковые слитые антигены ML 0405 и ML 2331, используемые в виде конъюгата с полусинтетическим дисахаридом (ND). На основе данных антигенов созданы серодиагностические тест-системы.

Тест ИФА (Нидерланды, Бразилия, Япония) на основе ФГЛ-1 (IPTSP/UFG) обнаруживает специфические IgM-антитела. Чувствительность при классификации больных многобактериальной формой (МБ) составляет 97,4 %, специфичность теста - 90,2 %. У пациентов с малобактериальной формой чувствительность составляет 40 %, у пациентов, имеющих бытовые контакты с лепрозными больными (проживающими в одной семье) - 28,6 %.

В 2001 г. Бразилией совместно с Нидерландами был разработан иммунохроматографический тест (ИХ-тест) "ML-Flow", альтернативный серологическому ИФА, который помог классифицировать пациентов с различными клиническими формами лепры. Чувствительность теста составила 77 %, специфичность - 93 %. Количественный экспресс-ИХ -тест (LF Test) NDO-LID^® (Orange Life, Rio de Janeiro, Brazil) основан на образовании специфических IgM- и IgG-антител против M. leprae. В качестве антигенов использовался полусинтетический дисахарид (ND), прикрепленный к октиловому радикалу (O) (аналог PGL-1), конъюгированный с двумя слитыми белками ML0405 и ML2331 (LID-1). Чувствительность теста - 87 % для многобактериальной формы (МВ) и 32,3 % для малобактериальной формы (РВ), специфичность - 97,4 %.

В качестве диагностических компонентов для иммунодиагностичеких тест-систем используются и Th1-цитокины, которые при взаимодействии с макрофагами, НК-клетками и цитотоксическими Т-лимфоцитами стимулируют клеточный иммунный ответ.

Поскольку исход инфекции M. leprae определяется клеточным и гуморальным иммунитетом, были разработаны комбинированные диагностические тесты, выявляющие про- и противовоспалительные цитокины, а также антитела против антигенов M. leprae. Таким примером является ИХ-тест, выявляющий цитокины и IgM против M. leprae - UCP-LFA (up-converting phosphor lateral flow assays) (Нидерланды). Чувствительность теста варьировала от 78 до 94 % для МВ и 28-44 % для РВ. В данном случае, компонентами для тестов послужили IP-10 (ИФН-γ-индуцибельный белок) и ФГЛ-1 в формате вертикальной ИХ, выявляющие про- или противовоспалительные цитокины, а также антитела к M. leprae.

Иммунологический аспект является ключевым при данном заболевании, так как иммунный ответ хозяина определяет клиническое проявление заболевания. Иммунодепрессия приводит к наиболее тяжелым проявлениям лепры. Клиническая картина коррелирует с качеством иммунного ответа. Поляризация специфического иммунного ответа к M. leprae является важным звеном в патогенезе лепры [20]. Сравнительный иммунохимический анализ антигенов различной природы дает более четкое представление о некоторых различиях в иммунном ответе между пациентами с лепроматозной и туберкулоидной формами заболевания, а также иллюстрирует гетерогенность гуморального иммунного ответа на белковые, углеводные и гликолипидные антигены в пределах одной клинической группы [7].

Туберкулоидная форма лепры является результатом высокого клеточного иммунитета с сильным иммунным ответом Th1-типа, проявляется немногочисленными локализованными поражениями кожи (≤ 5) и нервов, и малой бациллярной нагрузкой (в этом случае гуморальный иммунный ответ не детектируется). Лепроматозная форма характеризуется низким клеточно-опосредованным иммунитетом с преобладающим гуморальным ответом Th2-типа (высокая продукция IgG- или IgM-антител), что приводит к неадекватному иммунному ответу и к неконтролируемому размножению бактерий. Как результат - многочисленные поражения кожи (≥ 6) и большое количество бактерий в зонах поражения. У большинства людей, обладающих адекватной иммунореактивностью, которые имели контакт с больными лепрой, данное заболевание не развивается, тогда как у людей заболевших, по данным множества исследований, имеется генетическая предрасположенность к лепре.

Результаты применения различных антигенов для серодиагностики лепры в мире доказывают, что показатели чувствительности и специфичности иммунодиагностических методов имеют корреляции между типами используемых антигенов. Это зависит от географического расположения эндемичных территорий, типа заболевания, бактериальной нагрузки организма. В настоящее время не существует вакцины, которая обеспечивает защиту от лепры, однако было показано, что введение БЦЖ обеспечивает некоторую защиту среди лиц, восприимчивых к инфекции M. leprae. Хотя вакцина БЦЖ изначально предназначена для использования против M. tuberculosis, предполагаемый механизм защитных свойств БЦЖ против M. leprae включает перекрестную реактивность В- и Т-клеток против антигенов, общих для разных видов микобактерий. В связи с этим полученная нами невысокая специфичность, вероятно, является следствием перекрестных реакций на введение вакцины БЦЖ.

Для уточнения показателей диагностического потенциала исследуемых нами антигенов планируется расширение панели исследуемых сывороток крови, а именно сывороток крови здоровых доноров из эндемичной и неэндемичной областей; сывороток крови пациентов, положительных на лепру и туберкулез, с различными формами заболевания.

В результате проведенной работы были изготовлены 3 кандидатных рекомбинантных антигена: ML0050, ML0576 и ML0050-ML0576, которые методом химического синтеза были конъюгированы с БСА. Данные антигены были исследованы в ИФА и ИХА по способности выявлять в сыворотках крови человека суммарные IgA-, IgG- и IgM-антитела против антигенов M. leprae.

Для проведения ИХА было изготовлено 3 серии экспериментальных ИХ-тестов для ускоренной серодиагностики лепры: на основе ML0050-БСА, ML0576-БСА и ML0050-ML0576-БСА. Все 3 кандидатных антигена в различной степени специфически взаимодействовали с антителами из сывороток крови больных лепроматозной формой лепры, но наиболее перспективным для серодиагностики оказался слитый белок ML0050-ML0576-БСА. Полученные результаты свидетельствуют о том, что рекомбинантные белки ML0050 и ML0576 могут служить средством оценки гуморального иммунитета к M. leprae даже несмотря на перекрестную реактивность, варьирующую в пределах от 16 до 32 %.

Показатели низкой чувствительности, по-видимому, связаны с низкой бактериальной нагрузкой у больных лепрой, от которых получены сыворотки крови. Низкая специфичность, вероятнее всего, обусловлена перекрестной реактивностью сывороток крови здоровых доноров, вакцинированных БЦЖ, на рекомбинантные антигены M. leprae.

Следует учитывать, что для повышения достоверности оценки результатов необходимо будет расширить панель используемых сывороток крови, что на данный момент не представляется возможным ввиду отсутствия достаточного количества референс-сывороток. Вследствие этого проведение отбора антигенов с использованием ограниченного количества сывороток крови не позволило провести тестирование, которое учитывало бы географические и индивидуальные гетерогенности антительного ответа при лепре.

Заключение

В результате данной работы были получены рекомбинантные белки и их конъюгаты с БСА: ML0050-БСА; ML0576-БСА; ML0050-ML0576-БСА. При сравнительном анализе результатов иммунохимической активности данных конъюгатов в ИФА и ИХА с панелью сывороток крови пациентов наибольшая диагностическая чувствительность (с сыворотками крови пациентов, больных лепрой) и специфичность (с сыворотками крови здоровых доноров) в серотестах наблюдалась при использовании в качестве антигенного компонента ML0050-ML0576-БСА (конъюгат слитого рекомбинантного белка ML0050-ML0576 с БСА). Также тесты на основе данного конъюгата имели наименьший показатель перекрестной реактивности с сыворотками крови больных туберкулезом.

В результате проведенного исследования показана возможность применения рекомбинантных микобактериальных антигенов в серологических исследованиях при лепре (в частности, в качестве антигенов для проведения ИФА и ИХА).

На основании полученных данных можно сделать вывод о пригодности данного антигена для дальнейших исследований и перспективы создания на его основе отечественных серологических тестов для диагностики лепры, что дает мотивацию для получения новых рекомбинантных белков и их комбинаций для достижения более высоких диагностических показателей в иммунодиагностических тестах.

Литература/References

1. Leprosy - World Health Organization. URL: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/leprosy.

2. Ridley D.S., Jopling W.H. Classification of leprosy according to immunity. A five-group system. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 1966; 3 (34): 255-73. PMID: 5950347.

3. WHO Expert Committee on Leprosy. World Health Organization. 1998; Geneva, Switzerland. URL: https://apps.who.int/iris/handle/10665/42060.

4. Espinosa O.A., Ferreira S.B.M., Palacio F.G.L., et al. Accuracy of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) in detecting antibodies against Mycobacterium leprae in leprosy patients: a systematic review and meta-analysis. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2018; ID 9828023. Open Access. DOI: https://doi.org/10.1155/2018/9828023

5. Spencer J.S., Duthie M.S., Geluk A., Balagon M.F., Kim H.J., Wheat W.H., Chatterjee D., Jackson M., Li W., Kurihara J.N., Maghanoy A., Mallari I., Saunderson P., Brennan P.J., Dockrell H.M. Identification of serological biomarkers of infection, disease progression and treatment efficacy for leprosy. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2012; 107, Suppl 1: 79-89. DOI: https://doi.org/10.1590/s0074-02762012000900014.

6. Bobosha K., Tjon Kon Fat E.M., van den Eeden S.J., Bekele Y., van der Ploeg-van Schip J.J., de Dood C.J., Dijkman K., Franken K.L., Wilson L., Aseffa A., Spencer J.S., Ottenhoff T.H., Corstjens P.L., Geluk A. Field-evaluation of a new lateral flow assay for detection of cellular and humoral immunity against Mycobacterium leprae. PLoS Negl Trop Dis. 2014; 8 (5): e2845. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002845

7. Geluk A. Challenges in immunodiagnostic tests for leprosy. Expert Opin Med Diagn. 2013; 7 (3): 265-74. DOI: https://doi.org/10.1517/17530059.2013.786039

8. Reece S.T., Ireton G., Mohamath R., Guderian J., Goto W., Gelber R., Groathouse N., Spencer J., Brennan P., Reed S.G. ML0405 and ML2331 are antigens of Mycobacterium leprae with potential for diagnosis of leprosy. Clin Vaccine Immunol. 2006; 13 (3): 333-40. DOI: https://doi.org/10.1128/CVI.13.3.333-340.2006

9. Cole S.T., Eiglmeier K., Parkhill J., James K.D., Thomson N.R., Wheeler P.R., Honoré N., Garnier T., Churcher C., Harris D., Mungall K., Basham D., Brown D., Chillingworth T., Connor R., Davies R.M., Devlin K., Duthoy S., Feltwell T., Fraser A., Hamlin N., Holroyd S., Hornsby T., Jagels K., Lacroix C., Maclean J., Moule S., Murphy L., Oliver K., Quail M.A., Rajandream M.A., Rutherford K.M., Rutter S., Seeger K., Simon S., Simmonds M., Skelton J., Squares R., Squares S., Stevens K., Taylor K., Whitehead S., Woodward J.R., Barrell B.G. Massive gene decay in the leprosy bacillus. Nature. 2001; 409(6823): 1007-11. DOI: https://doi.org/10.1038/35059006

10. Barbosa M.D.S, de Sousa I.B.A., Simionatto S., Borsuk S., Marchioro S.B. Recombinant polypeptide of Mycobacterium leprae as a potential tool for serological detection of leprosy. AMB Express. 2019; 9 (1): 201. DOI: https://doi.org/10.1186/s13568-019-0928-9

11. Geluk A., Meijgaarden K.E., Franken K.L., Wieles B., Arend S.M., Faber W.R., Naafs B., Ottenhoff T.H. Immunological crossreactivity of the Mycobacterium leprae CFP-10 with its homologue in Mycobacterium tuberculosis. Scand. J. Immunol. 2004; 59 (1): 66-70. DOI: https://doi.org/10.1111/j.0300-9475.2004.01358.x

12. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227 (5259): 680-5. DOI: https://doi.org/10.1038/227680a0

13. Towbin H.T., Staehelin T.T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1979; 76 (9): 4350-4. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.76.9.4350

14. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951; 193 (1): 26-575. PMID: 14907713

15. Abronina P.I., Podvalnyy N.M., Mel’nikova T.M., Zinin A.I., Fedina K.G., Kachala V.V., Torgov V.I., Kononov L.O. Synthesis of covalent conjugates of hexaarabinofuranoside with proteins and their testing as antigens for serodiagnosis of tuberculosis. Russ Chem Bull. 2010; 59: 2333-7. DOI: https://doi.org/10.1007/s11172-010-0397-4

16. Kondakov N.N., Mel’nikova T.M., Chekryzhova T.V., Mel’nikova M.V., Zinin A.I., Torgov V.I., Chizhov A.O., Kononov L.O. Synthesis of a disaccharide of phenolic glycolipid from Mycobacterium leprae (PGL-I) and its conjugates with bovine serum albumin. Russ Chem Bull. 2015; 64: 114-28. DOI: https://doi.org/10.1007/s11172-015-0991-6

17. Королёва-Ушакова А.Г., Баранова Е.В., Игнатов С.Г., Соловьёв П.В., Кондаков Н.Н., Мельникова Т.М., Абронина П.И., Подвальный Н.М., Кононов Л.О., Бикетов С.Ф. Сравнительная характеристика диагностического потенциала микобактериальных синтетических антигенов для серодиагностики лепры и туберкулеза. Прикладная биохимия и микробиология. 2019; 55: 608-16. DOI: https://doi.org/10.1134/S0555109919060096 [Korolyova-Ushakova A.G., Baranova E.V., Ignatov S.G., Soloviev P.V., Kondakov N.N., Mel’nikova T.M., Abronina P.I., Podval’nyi N.M., Kononov L.O., Biketov S.F. Comparative characteristics of the diagnostic potential of mycobacterial synthetic antigens for the seroriagnosis of lepra and tuberculosis. Appl Biochem Microbiol. 2019; 55: 696-703. DOI: https://doi.org/10.1134/s0003683819060097 (in Russian)]

18. Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Nat Phys Sci. 1973; 241 (105): 20-2. DOI: https://doi.org/10.1038/physci241020a0

19. Hermanson G.T. Bioconjugate techniques. Acad Press. 2013; DOI: https://doi.org/10.1016/b978-0-12-342335-1.x5000-3

20. Fonseca A.B., Simon M.D., Cazzaniga R.A., de Moura T.R, de Almeida R.P., Duthie M.S., Reed S.G., de Jesus A.R. The influence of innate and adaptative immune responses on the differential clinical outcomes of leprosy. Infect Dis Poverty. 2017; 6 (1): 5. DOI: https://doi.org/10.1186/s40249-016-0229-3

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)