Проектирование и получение пептидов
Структуры полученных пептидов приведены в табл. 1. Все пептиды были успешно получены по приведенной методологии, о чем свидетельствуют данные масс-спектрометрии, подтвердившие структуры пептидов, и данных ЗКЭ о чистоте пептидов, также приведенные в табл. 1.
Согласно проекциям, приведенным на рис. 1, можно сделать вывод о значительных различиях в структурах SA-37, SA-38 и SA-52.
Пептид SA-32 является дендримерным, имеет 8 N-концов, представленных катионогенными остатками аргинина, ядро с гидрофобностью, повышенной присутствием остатков тирозина, и гидрофобный C-конец. Для SA-32 предполагается склонность к образованию мицелл за счет описанных участков, сильно разнящихся в полярности. Номинальный заряд (+16) означает, что молекула пептида может быть акцептором 16 протонов.
Структура SA-37 основана на потенциальном α-спиральном кластере 1622-1639 человеческого коллагена 18-го типа. Этот участок входит в состав эндостатина - лиганда нуклеолина. Эндостатин является протеолитическим фрагментом коллагена и нативным цитостатиком организма человека. Номинальный заряд: (+2); номинальная гидрофобность <H>: 0,207; гидрофобный момент (показатель амфипатичности спирали; чем ближе значение к 1,000, тем выше амфипатичность, чем ближе к 0,000, тем ниже) <µH>: 0,360.
Пептид SA-38 представляет собой фрагмент белка слияния РСВ. Представление о потенциальной активности данного пептида основывается на предположении о большей скорости его взаимодействия с клеточным нуклеолином, чем у полноценного белка слияния, что должно приводить к блокированию рецептора. Белок слияния РСВ имеет несколько форм существования, из них с нуклеолином связывается первичная - F0. В своем составе F0 имеет суперспираль на участке 91-114, которая, как установлено, используется для связи с нуклеолином. Номинальный заряд: (+1); <H>: 0,210; <µH>: 0,229.
Структура SA-51 основана на последовательности SA-40, о свойствах которого ранее докладывалось в [14, 15]. Основные отличия SA-51 от SA-40 - отсутствие остатков цистеина, что, предполагается, повышает его окислительную стабильность, а также ввод в структуру остатков β-аланина, выполненный с целью повышения устойчивости пептида к ферментативному гидролизу. SA-51 имеет 2 катионогенных N-конца и гидрофильный C-конец; в середине его структуры присутствуют катионогенные остатки лизина и гидрофобные остатки валина и фенилаланина, создающие локальную амфипатичность. Номинальный заряд: (+9).
Пептид SA-52 содержит остатки непротеиногенных аминокислот - орнитина и β-аланина. При своей схожести с остатками лизина остатки орнитина примечательны склонностью к формированию компактных и ригидных α-спиралей, что достигается за счет укороченной боковой цепи орнитина. Следует отметить, что орнитин является нативной для организма человека аминокислотой. Номинальный заряд: (+6); <H>: 0,011; <µH>: 0,063. Можно предположить, что SA-52 является достаточно гидрофильным пептидом, и для его гипотетической спирали не характерна амфипатичность. У его проекции не выделяются гидрофобная и гидрофильная стороны.
Пептид AB-30 обладает аминокислотной последовательностью (YKKIRVRLS)2KYAS, он использовался в исследовании противовирусной активности, где не обладал значительным эффектом, в качестве отрицательного контроля.
Цитотоксичность
График зависимости доли выживших клеток от концентрации добавленных пептидов приведен на рис. 2. Значения CC50 для всех пептидов приведены в табл. 2 и, кроме такового для SA-32, были > 2,5 мг/мл, что свидетельствует о низкой цитотоксичности.
Противовирусная активность
Для всех пептидов была продемонстрирована значительная противовирусная активность, она приведена на рис. 3 и в табл. 2. Все пептиды превосходили или были равны по данному показателю с препаратом моноклональных антител.
Для учета различия образцов использованных солей пептидов в количественном содержании оснований пептидов их количества в образцах были определены методом автоматического элементного анализа и приведены в табл. 3. На основании этих значений, а также данных об ингибировании формирования синцитиев РСВ из табл. 2 по уравнению (1) была рассчитана удельная противовирусная активность полученных пептидов (далее - pA), также представленная в табл. 3 в виде десятичного логарифма отношения остаточной жизнеспособности вируса к количеству основания пептида:
где pA - удельная противовирусная активность, A - процент ингибирования формирования синцитиев РСВ, ν - количество основания пептида в нМоль.
Обсуждение
Наиболее токсичным для клеток оказался пептид SA-32. Предполагается, что SA-32 также наиболее устойчив к ферментативному гидролизу: такое свойство для пептидных дендримеров известно из литературы [16], а также из ранее описанных нами экспериментов [13]. Увеличенный период полужизни может влиять на проявление отложенной цитотоксичности.
В то же время все пептиды, кроме AB-30, продемонстрировали значительную активность против РСВ. Наиболее активным пептидом также является SA-32. Исследованные пептиды можно разделить на 3 группы: катионные разветвленные - AB-30, SA-32 и SA-51, нейтральные амфифильные - SA-37 и SA-38 и единственный катионный гидрофильный SA-52. На основе полученных данных можно сделать вывод, что значительный вклад в противовирусное действие пептидов вносят катионогенные остатки лизина, орнитина и аргинина, а также ароматические остатки фенилаланина и тирозина. Можно предположить, что прочие аминокислоты в составе пептидов не оказали однозначного влияния на противовирусную активность.
Для лучшего сравнения активности пептидов мы рассчитали и использовали значения pA (см. табл. 3). Активность возрастает в ряду: SA-52 → SA-37 → SA-38 → SA-51 → SA-32. По рассчитанным значениям pA можно сделать вывод о том, что в действительности катионный гидрофильный пептид SA-52 обладает наименьшей противовирусной активностью. При этом различия между наиболее цитотоксичным SA-32 и вторым по противовирусной активности нетоксичным SA-51 оказываются несколько более значительными, чем в табл. 2.
Амфипатичные пептиды SA-37 и SA-38, в свою очередь, отличаются друг от друга аминокислотным составом и расположением аминокислот в структуре: SA-37 имеет более равнозначные гидрофильную и гидрофобную стороны гипотетической спирали, чем SA-38, для спиральной формы которого характерно преобладание гидрофильной стороны над гидрофобной. Мы полагаем, что именно эти различия приводят к ощутимой разнице между pA(SA-37) и pA(SA-38), - первый пептид близок по этому значению к SA-52, в то время как второй - к разветвленному SA-51. На наш взгляд, данные пептиды могут быть в дальнейшем использованы в разработке потенциальных противовирусных пептидных средств.
Выводы
1. Были успешно спроектированы, получены и проанализированы 5 новых синтетических противовирусных пептидов с высокой активностью против РСВ in vitro.
2. Разветвленные катионные пептиды обладают большей активностью в отношении РСВ, чем линейные.
3. Амфипатичность линейных пептидов вносит вклад в активность против РСВ, но не является обязательным для этого качеством.
4. Величина положительного заряда линейных пептидов в диапазоне (+1) - (+9) не вносит существенного вклада в активность против РСВ.
5. Длина амидной цепи вносит некоторый вклад в активность против РСВ. Противовирусные свойства обнаруживаются у 13-членного пептида, но удельная активность более длинных линейных пептидов (17 и 25 остатков) выше.
6. Активностью против РСВ обладают пептиды, содержащие остатки аргинина, лизина, орнитина, фенилаланина и тирозина, при этом расположение тирозина на N-концах, вероятно, отрицательно сказывается на активности AB-30, в то время как тирозин в середине цепи разветвленного пептида SA-32 не препятствует проявлению им значительных противовирусных свойств.
7. Содержание гидрофобных аминокислотных остатков в структуре пептида не коррелирует с его активностью против РСВ напрямую.
Литература
1. Geoghegan S., Erviti A., Caballero M.T., Vallone F., Zanone S.M., Losada J.V., Bianchi A., Acosta P.L., Talarico L.B., Ferretti A., Grimaldi L.A., Sancilio A., Dueñas K., Sastre G., Rodriguez A., Ferrero F., Barboza E., Gago G.F., Nocito C., Flamenco E., Perez A. R., Rebec B., Ferolla F.M., Libster R., Karron R.A., Bergel E., Polack F.P. Mortality due to respiratory syncytial virus. Burden and risk factors. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2017; 195 (1): 96-103. DOI: https://doi.org/10.1164/rccm.201603-0658OC
2. Langedijk A.C., Bont L.J. Respiratory syncytial virus infection and novel interventions. Nat. Rev. Microbiol. 2023; 21 (11): 734-49. DOI: https://doi.org/10.1038/s41579-023-00919-w
3. Currie S.M., Findlay E.G., McFarlane A.J., Fitch P.M., Böttcher B., Colegrave N., Paras A., Jozwik A., Chiu C., Schwarze J., Davidson D.J. Cathelicidins have direct antiviral activity against respiratory syncytial virus in vitro and protective function in vivo in mice and humans. J. Immunol. 2016; 196 (6): 2699-710. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1502478
4. Mulder K.C.L., Lima L.A., Miranda V.J., Dias S.C., Franco O.L. Current scenario of peptide-based drugs: the key roles of cationic antitumor and antiviral peptides. Front. Microbiol. 2013; 4: 321. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00321
5. Wegzyn C., Toh L.K., Notario G., Biguenet S., Unnebrink K., Park C., Makari D., Norton M. Safety and effectiveness of palivizumab in children at high risk of serious disease due to respiratory syncytial virus infection: a systematic review. Infect. Dis. Ther. 2014; 3 (2): 133-58. DOI: https://doi.org/10.1007/s40121-014-0046-6
6. Aravinda S., Shamala N., Roy R.S., Balaram P. Non-protein amino acids in peptide design. J. Chem. Sci. 2003; 115: 373-400. DOI: https://doi.org/10.1007/bf02708230
7. Хаитов М.Р., Никонова А.А., Шиловский И.П., Кожихова К.В., Кофиади И.А., Гудима Г.О., Вишнякова Л.И., Никольский А.А., Ковчина В.И., Тимотиевич Е.Д., Юмашев К.В., Смирнов В.В., Маерле А.В., Козлов И.Б., Шатилов А.А., Шатилова А.В., Андреев С.М., Колоскова О.О., Кузнецова Н.А., Васина Д.В., Никифорова М.А., Рыбалкин С.П., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Мартынов А.И., Берзин И.А., Гущин В.А., Ковальчук А.В., Борисевич С.В., Скворцова В.И. МИР 19® - первый в мире специфический противовирусный препарат для лечения COVID-19: разработка и доклинические исследования. Иммунология. 2023; 44 (3): 270-90. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-3-270-290
8. Хаитов М.Р., Никонова А.А., Кофиади И.А., Шиловский И.П., Смирнов В.В., Елисютина О.Г., Гудима Г.О., Маерле А.В., Шатилов А.А., Шатилова А.В., Андреев С.М., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Латышева Т.В., Ильина Н.И., Мартынов А.И., Рабдано С.О., Рузанова Э.А., Савельев Н.С., Плетюхина Ю.В. Сафи А.С., Ратников В.А., Горелов В.П., Кащенко В.А., Кучеренко Н.Г., Умарова И.А., Москалева С.С., Фабричников С.В., Зуев О.В., Павлов Н.Б., Крючко Д.С., Берзин И.А., Горячев Д.В., Меркулов В.А., Шипулин Г.А., Юдин С.М., Трухин В.П., Валента Р., Скворцова В.И. Результаты I и II фазы клинических исследований препарата МИР 19®. Иммунология. 2023; 44 (3): 291-316. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2023-44-3-291-316
9. Sinclair J.F., O’Brien A.D. Intimin types α, β, and γ bind to nucleolin with equivalent affinity but lower avidity than to the translocated intimin receptor. J. Biol. Chem. 2004; 279 (32): 33751-8. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M401616200
10. Song N., Ding Y., Zhuo W., He T., Fu Z., Chen Y., Song X., Fu Y., Luo Y. The nuclear translocation of endostatin is mediated by its receptor nucleolin in endothelial cells. Angiogenesis. 2012; 15 (4): 697-711. DOI: https://doi.org/10.1007/s10456-012-9284-y
11. Watanabe T., Hirano K., Takahashi, A. Yamaguchi K., Beppu M., Fujiki H., Suganuma M. Nucleolin on the cell surface as a new molecular target for gastric cancer treatment. Biol. Pharm. Bull. 2010; 33 (5): 796-803. DOI: https://doi.org/10.1248/bpb.33.796
12. Gautier R., Douguet D., Antonny B., Drin G. HELIQUEST: a web server to screen sequences with specific α-helical properties. Bioinformatics. 2008; 24 (18): 2101-2. DOI: https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btn392
13. Kozhikhova K.V., Shilovskiy I.P., Shatilov A.A., Timofeeva A.V., Turetskiy E.A., Vishniakova L.I., Nikolskii A.A., Barvinskaya E.D., Karthikeyan S., Smirnov V.V., Kudlay D.A., Andreev S.M., Khaitov M.R. Linear and dendrimeric antiviral peptides: Design, chemical synthesis and activity against human respiratory syncytial virus. J. Mat. Chem. B. 2020; 13 (8): 2607-17. DOI: https://doi.org/10.1039/C9TB02485A
14. Кожихова К.В., Андреев С.М., Успенская Д.В., Шатилова А.В., Турецкий Е.А., Шатилов А.А., Лушникова А.А., Вишнякова Л.И., Шиловский И.П., Смирнов В.В., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Суперкатионные пептидные дендримеры как векторы для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих. Иммунология. 2022; 43 (3): 320-32. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-3-320-332
15. Шатилов А.А., Шатилова А.В., Миславский О.В., Черченко Н.Г., Сапрыгина Л.В., Бабихина М.О., Смирнов В.В., Хаитов М.Р. Оценка эффективности применения поликатионных дендримерных пептидов в качестве ковалентных адъювантов рекомбинантного аллергена пыльцы березы rBet v 1. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2023; 22S6: 102-3. DOI: https://doi.org/10.15829/1728-8800-2023-6S
16. Sommer P., Fluxa V.S., Darbre T., Reymond J. Proteolysis of peptide dendrimers. Chembiochem. 2009; 10 (9): 1527-36. DOI: https://doi.org/10.1002/cbic.200900060