Особенности и ключевые параметры валидации методик фенотипирования клеточных линий, входящих в состав препаратов клеточной терапии

• Покровский Никита Станиславович
• Водякова Марина Андреевна
• Меркулов Вадим Анатольевич
• Мельникова Екатерина Валерьевна

Резюме

Подлинность (идентичность) клеточных линий (клеток) является одним из важнейших показателей качества препаратов на основе жизнеспособных клеток человека. Иммунофенотипическая характеристика клеток человека имеет основополагающее значение для идентификации препаратов клеточной терапии перед клиническим применением. Проточная цитометрия - метод, наиболее широко используемый для фенотипирования клеточных линий. Исследование посвящено анализу особенностей валидации методик фенотипирования клеточных линий. В рамках данного исследования были рассмотрены ключевые параметры процесса валидации методики, а также актуальные данные об особенностях валидации, связанные с препаратами клеточной терапии, используемыми реактивами и оборудованием, редкими событиями и компенсацией.

Ключевые слова:валидация; фенотипирование; проточная цитометрия; контроль качества; клеточные линии

Введение

Анализы, проводимые методом проточной цитофлуориметрии, используются на всех стадиях процесса разработки препаратов на основе жизнеспособных клеток человека: биомедицинских клеточных продуктов (БМКП) и высокотехнологичных лекарственных препаратов (ВТЛП), а также при оценке их качества [1]. Эта технология позволяет проводить идентификацию клеточных маркеров на поверхности клеток, а также специфичные измерения в ее внутренних структурах. Метод проточной цитофлуориметрии также подходит для количественного определения растворимых аналитов (цитокинов, фармацевтических субстанций, антител в образцах плазмы или сыворотки). Преимуществом метода проточной цитофлуориметрии является его способность к многопараметрическому анализу, что позволяет одновременно определять различные функциональные характеристики клетки [2, 3].

Проточная цитофлуориметрия применяется для анализа клеточного цикла, пролиферации, апоптоза, внутриклеточного сигналинга и многих других процессов в клетке. В некоторых клинических исследованиях подсчет (абсолютного значения и долей популяции) таких клеток, как CD3⁺CD4⁺- и CD3⁺CD8⁺-Т-клетки, B- и НК-клетки, методом проточной цитофлуориметрии является основной задачей оценки эффективности или ответа на терапию [3].

Определение идентичности клеточной линии в составе БМКП/ВТЛП может заключаться в определении фенотипического, генотипического и морфологического профиля. Иммунофенотипическая характеристика клеточных линий имеет основополагающее значение для идентификации препарата клеточной терапии перед его клиническим применением. Проточная цитометрия - наиболее широко используемый метод иммунофенотипического анализа, который позволяет быстро и по многим параметрам анализировать клеточную суспензию и подразумевает демонстрацию пригодности (валидацию) для каждой клеточной линии (определенного типа целевых клеток). Следует отметить, что оценка некоторых аналитических измерений (чувствительность, правильность и линейность) для валидации этого метода затруднена из-за отсутствия клеточных референсных материалов и сложности получения адекватных контролей (например, клеточных линий с различными уровнями экспрессии данного маркера) [4].

По сравнению с другими часто используемыми методами, обычно применяемыми в разработке лекарственных препаратов (например, масс-спектрометрия), процесс валидации методик проточной цитофлуориметрии представляет определенные трудности, заключающиеся в присутствии клеточного материала в образцах, специфических реагентах, в большинстве случаев отсутствии клеточного стандарта и технически сложном оборудовании [3]. Кроме того, необходимо отметить небольшое количество научных работ в области валидации метода проточной цитометрии непосредственно для препаратов на основе жизнеспособных клеток [4].

В 2013 г. группой экспертов Международного совета по стандартизации в гематологии (ICSH - International Council for Standardization in Haematology) и Международного общества клинической цитометрии (ICCS - International Clinical Cytometry Society) были разработаны основные принципы, которые должны служить эталоном для проточной цитофлуориметрии независимо от того, используются ли они для тестирования образцов, полученных от пациентов в процессе клинических испытаний (например, в целях исследования эффективности нового диагностического или терапевтического продукта), или разработки нового устройства для диагностики in vitro с использованием этой технологии [5-9].

В настоящее время не существует официальных научно-методических документов (руководств) по валидации анализов, выполняемых методом проточной цитометрии, в том числе единых принятых стандартов для оценки воспроизводимости, правильности и межлабораторной прецизионности.

Общие подходы к использованию метода проточной цитометрии для разработки, проверки, контроля, проведения и внедрения флуоресцентных клеточных анализов любой лабораторией представлены в Руководстве Н62 [3, 10]. Данное руководство содержит рекомендации по подходу "fit-for-purpose" (целеориентированный подход) к валидации методик, выполняемых с помощью проточной цитофлуориметрии. Этот подход подразумевает, что разработка дизайна и непосредственно валидация проводятся в зависимости от преследуемых исследователями целей и планируемого использования полученных данных. Если в период применения методики, для которой проводится валидация, изменится предполагаемое использование данных, необходимо рассмотреть дополнительные параметры, связанные с новыми задачами [11].

Таким образом, в настоящее время отсутствует детальная информация по особенностям и перечню необходимых параметров для надлежащей валидации специфических методик, выполняемых с помощью проточной цитофлуориметрии применительно к препаратам клеточной терапии (БМКП/ВТЛП).

Цель данной работы - анализ особенностей, характерных для валидации методик проточной цитофлуориметрии для оценки идентичности (подлинности) препаратов на основе жизнеспособных клеток человека с помощью иммунофенотипирования.

Принцип работы проточного цитофлуориметра

Проточный цитофлуориметр (цитометр) - это устройство, используемое в молекулярной и клеточной биологии для анализа и подсчета клеток, частиц, растворимых белков и других биологических объектов на основе их оптических свойств. Он состоит из жидкостной (флюидной), оптической и электронной систем. Жидкостная система фокусирует образец в проточной ячейке путем обжимания его со всех сторон буферным раствором, выстраивая клетки или частицы в одиночный ряд. Наличие такой системы необходимо для формирования потока отдельных клеток. Далее поток протекает перпендикулярно лазерному лучу и флуорохромы на поверхности частиц и клеток излучают световые сигналы с длиной волны, большей, чем длина волны источника излучения. В то же время сама по себе частица преломляет и рассеивает попадающий на нее свет на той же длине волны, что и излучатель. Этот преломленный и рассеянный свет проходит через оптическую систему и попадает на детекторы. Затем электронная система светочувствительных элементов детектирует и преобразует сигнал, регистрируя значение основных параметров, которые измеряются проточным цитофлуориметром, таких как флуоресценция (от флуорохрома и автофлуоресценция), прямое (FSC) и боковое (SSC) рассеяние.

Система детектирования проточного цитофлуориметра состоит из фотодетекторов и спектральных фильтров, которые позволяют измерять интенсивность света при разных длинах волн. Эта информация используется для создания многомерного профиля каждой клетки, что позволяет исследователям анализировать ее характеристики и классифицировать в соответствии с определенными критериями.

Степень и характер рассеяния света от клетки зависит от множества факторов, таких как размер, форма, внутренняя структура клетки, ее индекс рефракции, среда и даже углы, под которыми располагаются детекторы. В общем случае, показатель FSC свидетельствует о размере клетки, а показатель SSC коррелирует со сложностью внутренней структуры клетки. Наиболее полезным стандартом для первоначальной настройки проточного цитометра будут непосредственно те клетки, которые используются в анализе [7].

Настройка параметров цитометра для конкретных типов анализа является ключевым этапом в многопараметрическом анализе фенотипа клеток и включает настройку дискриминатора для различения отдельных клеток и частиц, параметров светорассеяния для измерения их размера и структуры, чувствительности детекторов флуоресценции при определении типа и количества флуорохрома и введение коэффициентов компенсации для корректировки результатов измерений флуоресценции и учета перекрытия спектров излучения различных флуорохромов.

Ключевые параметры процесса валидации методик иммунофенотипирования

Классическое определение валидации аналитической методики заключается в подтверждении, что все необходимые требования для ее предполагаемого применения выполнены посредством проверок и представления объективных доказательств. Валидация методики означает успешную демонстрацию надежности метода, постоянства и правильности полученных с его помощью результатов путем проведения ряда действий, гарантирующих соответствие параметров валидации установленным критериям.

Согласно руководству ICH Q2 R2 [12], валидация каждой аналитической методики необходима для демонстрации того, что данный метод является подходящим для своей цели. Процесс валидации обычно состоит из четырех шагов: квалификация персонала и оборудования, описание стратегии валидации, непосредственно валидация, сбор данных и составление протоколов валидации [4, 13].

Протокол валидации должен четко описывать роли и зону ответственности каждого члена персонала, а также факторы, влияющие на процесс валидации (например, оборудование, расходные материалы, реагенты, стандартные образцы). Также должны быть описаны все параметры валидации, критерии их приемлемости, которые будут гарантировать успешную валидацию данной методики. Согласно ICH Q2 R2 и ОФС.1.1.0012 "Валидация аналитических методик" ГФ РФ XV, для валидации методик количественного анализа необходимо определять следующие основные параметры: правильность, прецизионность (повторяемость внутрилабораторная и межлабораторная), специфичность, предел обнаружения (limit of detection, LOD), предел количественного определения (limit of quantification, LOQ), линейность и аналитическая область [12, 13]. Но не все эти параметры в полном объеме могут быть определены в рамках методики иммунофенотипирования на проточном цитофлуориметре, что связано со сложностью этой технологии, недостатком (или отсутствием) охарактеризованных контрольных образцов и биоаналитической категорией данных, получаемых при иммунофенотипировании. Большинство данных, получаемых в ходе анализов методом проточной цитометрии, относятся к количественной биоаналитической категории (например, фармакокинетический анализ), однако методика иммунофенотипирования относится к квазиколичественным, поскольку численные значения, генерируемые образцами, пропорционально связаны с количеством аналита, но для них отсутствуют калибровочная кривая или контрольные значения (табл. 1) [14]. Например, если необходимо получить значения уровня экспрессии поверхностных маркеров CD19 и при этом калибровка интенсивности флуоресценции проводилась на калибровочных частицах, то полученные данные будут относиться к относительно количественным. Тогда калибровка возможна путем использования антиген-связывающих частиц или частиц с заранее известным числом связанных флуоресцентных молекул. Но даже в этом случае калибровочные образцы не могут полностью соответствовать тестовым.

Особенности валидации методики проточной цитометрии

Несмотря на существование в литературе ряда общих и специфических рекомендаций по валидации, как например руководство H62, адаптировать подобные руководства для применения к препаратам клеточной терапии - довольно непростая задача из-за специфических требований к образцам и к характеристике клеток с учетом множества параметров, которые должны определяться в различных комбинациях, а также из-за большого количества взаимодействующих между собой переменных каждого эксперимента [2, 10]. Далее будут рассмотрены особенности проведения валидации, связанные с различными аспектами анализа, свойственными методу проточной цитометрии.

Клеточные образцы/продукты

Не все подходы к валидации традиционных иммуноаналитических методик анализа можно легко адаптировать под препараты клеточной терапии. Одной из проблем является приготовление контролей в отношении анализа клеточных образцов, которое кардинально отличается от привычного приготовления контролей в анализах истинных растворов [5, 6]. В отличие от образцов в виде растворов, для которых смешивание двух образцов с разной концентрацией всегда приводит к известному результату, образцы, содержащие клетки с разными уровнями экспрессии анализируемого фактора (аналита), при смешивании будут показывать не усредненный показатель сигнала, а две отличные популяции с разными уровнями экспрессии. Это осложняет подход к изучению линейности метода.

Тот факт, что анализ методом проточной цитофлуориметрии проводится на образцах, содержащих клетки с уникальной экспрессией различных аналитов, их собственной аффинностью к красителям и другими индивидуальными характеристиками, создает определенные ограничения для проведения валидации, что не характерно для традиционных методов анализа.

Если лаборатория, проводящая валидацию метода проточной цитофлуориметрии, работает с клеточными банками, референсные значения низких и высоких уровней сигнала для конкретной клеточной линии могут быть определены, основываясь на данных, полученных на серии анализов в течение нескольких дней при выполнении несколькими операторами-аналитиками [3].

Неочевидной особенностью валидации методики проточной цитофлуориметрии является то, что одна и та же популяция клеток в разных образцах может иметь разный уровень аутофлуоресценции или фоновой флуоресценции, что затрудняет и осложняет подход к проведению валидации некоторых параметров, например чувствительности, пределов обнаружения и количественного определения. Из-за того, что не существует стандартных образцов, содержащих известное количество клеток, исследователь не может определить, является ли применяемая методика правильной с точки зрения валидации.

Определение прецизионности может осложняться сроком годности и стабильности клеточных образцов. При сроке жизнеспособности клеток крови не более 72 ч проведение эксперимента по определению уровня межлабораторной прецизионности на протяжении нескольких дней практически не осуществимо. Это обусловливается тем фактом, что некоторые клеточные поверхностные маркеры или определенные субпопуляции клеток могут быть утеряны, деградированы или изменены в процессе хранения или транспортировки образцов. Эффект влияния транспортировки образцов и их состояния на результаты анализа при необходимости рекомендуется изучить [2]. Помимо этого, такие параметры образца с жизнеспособными клетками человека, как экспрессия антигенов, клеточная композиция и жизнеспособность, имеют тенденцию изменяться с течением времени даже в пробирке, содержащей антикоагулянт. Аналогично исследование повторяемости на серии повторных анализов тоже часто ограничено малыми объемами доступного для работы образца [5, 6].

Также в результате проведения одного анализа методом проточной цитофлуориметрии в образце могут быть определены несколько различных популяций клеток, в то время как в более традиционных методах анализа одно измерение часто обозначает единственный результат. Это приводит к более сложным методам интерпретации результатов и сравнения нескольких образцов между собой.

Еще одной особенностью, связанной с наличием клеточного материала в образцах, в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute), является необходимость в ежедневном подсчете концентрации клеток и их жизнеспособности непосредственно перед проведением анализа, ввиду того, что жизнеспособность клеточных популяций со временем снижается даже при поддержке роста питательными средами [16]. Для большей достоверности результатов и экономии трудозатрат такой подсчет клеток рекомендуется проводить при помощи автоматического счетчика клеток. Однако стоит иметь в виду, что такой подход не оправдан, если известно, что в образце очень малое количество клеток или недостаточный объем образца не позволяет провести подсчет в автоматическом счетчике. В таком случае альтернативой будет ручной подсчет в камере гемоцитометра [5, 6] или цитометрические пробирки с заранее расфасованными частицами (например, BD Trucount). Какой бы метод подсчета концентрации клеток и их жизнеспособности в продуктах, содержащих клетки человека, ни был выбран, он также должен быть валидирован [17].

Эти особенности подготовки образцов для валидации методик, в котором анализируются жизнеспособные клетки человека в составе БМКП и ВТЛП, указывают на необходимость тщательного планирования при разработке дизайна процесса валидации, а также влияют на определение чувствительности, линейности, прецизионности, LOD и LOQ.

Используемые реактивы и оборудование

В мире на данный момент не существует "золотого стандарта" для определения правильности фенотипа определенной популяции клеток, а также абсолютной количественной величины, характеризующей этот параметр. Специфичность антител к определенным антигенам на поверхности клеток может широко варьировать в зависимости от клона, из которого они произведены, конъюгата, производителя и других параметров. С другой стороны, различные антитела могут связывать один и тот же антиген, что может повлиять на специфичность, если вероятность такого перекрестного связывания не будет учтена перед экспериментом или в ходе интерпретации результатов [2]. Расчет необходимого количества антител, которое будет добавлено в каждый образец, необходимо проводить, исходя из результата подсчета концентрации клеток в образце непосредственно в день анализа.

Широкий ассортимент различных флуорохромов, доступный на сегодняшний день для проточной цитофлуориметрии, обусловливает рекомендации проведения валидационных исследований для каждого красителя на достаточном количестве образцов (5 или более). Такой эксперимент позволит исследователям убедиться в том, что используемые ими красители не меняют экспрессию изучаемого антигена [5, 6].

В постоянно меняющемся ландшафте биологических знаний, новых методов терапии и открывающихся новых технологических возможностей (в котором новые и оптимизированные комбинации антител иногда приходится включать в существующие исследования для повышения качества анализа) важно, чтобы протоколы применения антител оставались гибкими [2]. Известно, что сигнал интенсивности флуоресценции может варьировать в определенном диапазоне в зависимости от прибора, его настроек, аналитика и лаборатории. Поэтому рекомендуется проводить калибровку прибора, используя стандарты и/или калибровочные частицы [3].

Калибровка проточного цитофлуориметра для анализа количества антител на поверхности клетки может проводиться несколькими способами. Первый подход основан на использовании калибровочных частиц с известным количеством молекул флуорохрома на своей поверхности, известным количеством антител, либо известным значением емкости или аффинности к определенным антигенам. Другой подход подразумевает калибровку на клетках с заранее определенным средним значением антител, которые способны связаться с поверхностными рецепторами клетки. Помимо калибровки путем измерения заранее охарактеризованных частиц или клеток, существует также метод программной компенсации различий сигнала между разными партиями одного и того же красителя или партиями калибровочных частиц [7]. Калибровка интенсивности флуоресценции на контрольных образцах крови является подходящей для валидации не только качества реагентов, но также и процесса окрашивания клеток и состояния образца.

В целом рекомендуется проводить валидацию на наиболее репрезентативных типах образцов, которые наилучшим образом представляют образцы, которые впоследствии будут использоваться в данном анализе.

Редкие события

В ходе разработки дизайна валидации цитофлуориметрического исследования образцов для экспертизы качества препарата клеточной терапии, а также диагностирования заболеваний или в рамках научно-исследовательской работы может возникнуть потребность в получении данных о редких или крайне редких событиях. Для достоверного результата редких событий требуется большое их количество (рис. 1), что значительно увеличивает минимально необходимое количество клеток в образце, которое следует проанализировать на приборе (табл. 2) [2].

Значения, указанные в табл. 2, получены на основе распределения Пуассона, которое при достаточно большом ожидаемом числе событий стремится к нормальному распределению.

На основе этого для получения других значений необходимо сперва определить количество событий, которое нужно получить на цитометре, исходя из коэффициента вариации (CV), требуемого в данном исследовании:

Затем вычислить минимальное требуемое количество клеток N по формуле:

В некоторых случаях, когда искомые события очень редки либо вариабельность результатов высока, могут понадобиться дополнительная оценка и статистический анализ.

Компенсация

Введение коэффициентов компенсации - это прием, используемый в проточной цитометрии для корректировки и минимизации искажения данных, получаемых, когда флуорохром имеет диапазон испускания, пересекающийся с каналами, не предназначенными для его детекции. Такие каналы называются вторичными, а единственный канал, в котором должен регистрироваться сигнал данного флуорохрома, называется первичным. Это важный этап проведения анализа, поэтому он должен быть учтен в процессе проведения валидации. Введение коэффициентов компенсации позволяет свести к минимуму засветы на вторичных каналах, которые могут влиять на результаты анализа. Компенсация выполняется вычитанием определенного процента сигнала, полученного в первичном канале, из сигналов во вторичных каналах.

Процесс ручной настройки флуоресцентной компенсации на детекторах цитофлуориметра основан на визуальной оценке представления полученных данных на графиках, в связи с чем подвержен ошибкам, связанным с субъективным восприятием оператора, проводящего настройку.

Для современных приборов и программного обеспечения существуют встроенные алгоритмы автоматической настройки компенсации напряжений, использование которых в большинстве случаев предпочтительнее, так как приводит к более повторяемым результатам. Применение таких алгоритмов - более простое и удобное решение этого вопроса, однако оно подразумевает использование специальных реагентов, которые значительно удорожают стоимость исследования [19].

Введение и регулировка коэффициентов компенсации в ходе валидации метода проточной цитофлуориметрии для БМКП/ВТЛП чрезвычайно важны, так как они помогают обеспечить надежность полученных данных с высокой правильностью и прецизионностью и минимизировать вероятность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов (поскольку сигнал каждого используемого флуорохрома регистрируется только в одном канале), а также увеличивает чувствительность детекции во вторичных каналах за счет уменьшения нежелательных сигналов. Использование этого инструмента также увеличивает разрешение анализа и, соответственно, его чувствительность, приводя к более точному результату анализа фенотипа целевых клеток в препаратах клеточной терапии.

Проведение валидации на двух или более приборах (даже одной и той же модели) имеет свои особенности в рамках анализа БМКП/ВТЛП методом проточной цитофлуориметрии. Коэффициент вариации между разными моделями одного типа прибора может достигать достаточно высоких величин (> 15 % CV), это необходимо принимать во внимание при использовании нескольких приборов в рамках проведения исследования [7]. Из-за того что чувствительность, заводская калибровка детекторов и параметры компенсации на каждом приборе могут немного отличаться, настройку нескольких приборов перед проведением валидации следует проводить с использованием калибровочных частиц или заранее охарактеризованных клеточных образцов. Поэтому при проведении исследования на более чем двух различных приборах полезно изучить величину относительной ошибки между ними, особенно, если анализ проводится на границе предела обнаружения, где различия в показаниях разных приборов могут быть значительными. Для этого можно провести анализ одного и того же контрольного образца последовательно на двух разных моделях прибора и таким образом определить величину их относительной ошибки, которую впоследствии можно будет компенсировать нормализацией полученных данных. Важно настроить оба прибора таким образом, чтобы результаты анализа одного и того же образца на разных приборах были наиболее схожими. В таком случае данные валидации по таким параметрам, как правильность, повторяемость и межлабораторная прецизионность, будут наиболее достоверными.

Если в лаборатории в наличии только один проточный цитометр, его абсолютный уровень производительности определять необязательно. Однако, несмотря на это, объективная оценка работы прибора крайне важна для гарантии получения стабильных результатов анализа [7].

Заключение

Фенотипирование клеточных линий (клеток) является одним из ключевых исследований в оценке качества и подтверждении подлинности препаратов на основе жизнеспособных клеток человека (БМКП/ВТЛП). Наиболее часто для выполнения фенотипирования используется проточная цитометрия, позволяющая в короткие сроки проанализировать клеточную суспензию по многим параметрам. Данная методика для каждой конкретной клеточной линии подразумевает валидацию, которая имеет множество особенностей.

В данном исследовании на основании анализа документов и научной литературы были выделены ключевые параметры валидации методики фенотипирования клеточных линий, которые включают основные: правильность, прецизионность, специфичность, предел обнаружения, предел количественного определения, линейность, аналитическая область; и дополняющие: чувствительность, граничное значение и фактор переноса.

Описаны особенности валидации методики, связанные с трудностями при работе с образцами, содержащими жизнеспособные клетки, используемыми реактивами и оборудованием, редкими событиями и компенсацией, и их воздействие на ключевые параметры валидации. Показана необходимость тщательного планирования дизайна процесса валидации вследствие сложности приготовления контролей, наличия индивидуальных характеристик клеток, разного уровня аутофлуоресценции, ограничений по сроку годности и стабильности образцов и других особенностей. Установлено, что из-за отсутствия единого стандарта для определения правильности фенотипа популяции клеток и количественной величины, характеризующей этот параметр, необходимо учитывать специфику работы с антителами в проточной цитометрии, вероятность перекрестного связывания, а также калибровку прибора для обеспечения точности измерений фенотипа популяции клеток. Кроме того, представлен метод расчета общего количества клеток, которое требуется для определения заданного количества редких событий, а также освещена проблема компенсации в проточной цитометрии, ее вклад в искажения получаемых данных и способы минимизации этих искажений для увеличения точности и чувствительности анализа и достижения надежных результатов.

В дальнейшем авторы планируют разработать рекомендации по составлению дизайна валидации методик проточной цитофлуориметрии, их проведению, получению и обработке результатов, а также выбору критериев приемлемости полученных результатов.

Литература

1. Трусов Г.А., Чапленко А.А., Семенова И.С., Мельникова Е.В., Олефир Ю.В. Применение проточной цитометрии для оценки качества биомедицинских клеточных продуктов. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2018; 18 (1): 16-24. DOI: https://doi.org/10.30895/2221-996X-2018-18-1-16-24

2. Lambert C., Yanikkaya D. G., Keller T., Preijers F., Psarra K., Schiemann M., Özçürümez M., Sack U. Flow Cytometric Analyses of Lymphocyte Markers in Immune Oncology: A Comprehensive Guidance for Validation Practice According to Laws and Standards. Front. Immunol. 2020; 11: 2169. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.02169

3. O’Hara D.M., Xu Y., Liang Z., Reddy M.P., Wu D.Y., Litwin V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. Journal of Immunological Methods. 2011; 363 (2): 120-34. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jim.2010.09.036

4. Viganò M., Budelli S., Lavazza C., Montemurro T., Montelatici E., De Cesare S., Lazzari L., Orlandi A.R., Lunghi G., Giordano R. Tips and Tricks for Validation of Quality Control Analytical Methods in Good Manufacturing Practice Mesenchymal Stromal Cell Production. Stem Cells International. 2018; 2018: 1-16. DOI: https://doi.org/10.1155/2018/3038565

5. Davis B.H., Wood B., Oldaker T., Barnett D. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS - part I - rationale and aims. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2013; 84 (5): 282-5. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.b.21104

6. Davis B.H., Dasgupta A., Kussick S., Han J.Y., Estrellado A. Validation of cell-based fluorescence assays: practice guidelines from the ICSH and ICCS - part II - preanalytical issues. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2013; 84 (5): 286-90. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.b.21105

7. Tangri S., Vall H., Kaplan D., Hoffman B., Purvis N., Porwit A., Hunsberger B., Shankey T.V. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS - part III - analytical issues. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2013; 84 (5): 291-308. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.b.21106

8. Barnett D., Louzao R., Gambell P., De J., Oldaker T., Hanson C.A. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS - part IV - postanalytic considerations. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2013; 84 (5): 309-14. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.b.21107

9. Wood B., Jevremovic D., Béné M.C., Yan M., Jacobs P., Litwin V. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS - part V - assay performance criteria. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2013; 84 (5): 315-23. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.b.21108

10. CLSI. H62. Validation of Assays Performed by Flow Cytometry. 1st ed. 2021. 234 p. ISBN: 978-1-68440-128-4

11. Lee J.W., Devanarayan V., Barrett Y.C., Weiner R., Allinson J., Fountain S., Keller S., Weinryb I., Green M., Duan L., Rogers J.A., Millham R., O’Brien P.J., Sailstad J., Khan M., Ray C., Wagner J.A. Fit-for-Purpose Method Development and Validation for Successful Biomarker Measurement. Pharm Res. 2006; 23 (2): 312-28. DOI: https://doi.org/10.1007/s11095-005-9045-3

12. European Medicines Agency (EMA). ICH Topic Q2 (R2) Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology. 2023. URL: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/ich-q2r2-guideline-validation-analytical-procedures-step-5-revision-1_en.pdf

13. Министерство Здравоохранения Российской Федерации. Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания. ОФС.1.1.0012 "Валидация аналитических методик". 2023. URL: https://pharmacopoeia.regmed.ru/pharmacopoeia/izdanie-15/1/1-1/validatsiya-analiticheskikh-metodik/

14.  Selliah N., Nash V., Eck S., Green C., Oldaker T., Stewart J., Vitaliti A., Litwin V. Flow Cytometry Method Validation Protocols. Current Protocols. 2023; 3 (8): e868. DOI: https://doi.org/10.1002/cpz1.868

15.  Sommer U., Eck S., Marszalek L., Stewart J.J., Bradford J., McCloskey T.W., Green C., Vitaliti A., Oldaker T., Litwin V. High-sensitivity flow cytometric assays: Considerations for design control and analytical validation for identification of Rare events. Cytometry Part B Clinical. 2021; 100 (1): 42-51. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.b.21949

16. CLSI. H42. Enumeration of Immunologically Defined Cell Populations by Flow Cytometry. 2^nd ed. 2007. 88 p. ISBN: 1-56238-640-9.

17.  Vodyakova M.A., Pokrovsky N.S., Melnikova E.V., Merkulov V.A. Recommendations for Validation of Automated Viable Cell Counting Methods (Review). Drug development & registration. 2023; 12 (4): 217-22. DOI: https://doi.org/10.33380/2305-2066-2023-12-4-1424

18.  Donnenberg A.D., Donnenberg V.S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 2007; 27 (3): 627-52. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cll.2007.05.013

19.  Хайдуков С.В. Подходы к стандартизации метода проточной цитометрии для иммунофенотипирования. Настройка цитометров и подготовка протоколов для анализа. Медицинская иммунология. 2014; 9 (6): 569. DOI: https://doi.org/10.15789/1563-0625-2007-6-569-574

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)