Инновационные подходы в иммунологии: мультиомика единичных клеток и пространственная транскриптомика

• Перик-Заводская Ольга Юрьевна
• Перик-Заводский Роман Юрьевич
• Сенников Сергей Витальевич

Резюме

Ключевые слова: омиксные технологии; биоинформатика; транскриптомика; геномика; протеомика; секвенирование РНК единичных клеток; пространственная транскриптомика

Введение

Все методы исследования имеют свои преимущества и ограничения. Революционные прорывы в науке формируются с появлением новых техник исследования, которые позволяют получать более качественную и разнообразную информацию об изучаемом объекте на принципиально новом уровне. Например, разрешающие возможности методов, основанных на применении антител, позволяют различать ограниченный репертуар изоформ белков, образующихся в результате альтернативного сплайсинга. В то же время известно, что в результате альтернативного сплайсинга образуются изоформы с разной биологической активностью вплоть до изменения активности белка с образованием форм, блокирующих эффекты полноразмерной формы. В ходе массового исследования мы изучаем суммарную активность разных типов клеток, а попытки выделить определенную популяцию клеток могут значительно изменить их транскрипционную и трансляционную активность - при получении чистых популяций клеток процесс выделения сопровождается активацией целевых популяций и получением неточной информации об экспрессии или продукции иммунорегуляторных медиаторов. В органах и тканях формируются различные структурно-функциональные единицы при развитии иммунных реакций, и только методы in situ наиболее близко могут отражать, как реально в ткани развертываются разные иммунные процессы и реакции. Наконец, для выполнения определенной функции в клетке запускается экспрессия групп генов, обеспечивающих эту функцию, и судить о том, что в клетке запущен процесс дифференцировки, активации, пролиферации или иной функции, нужно судить не по экспрессии 2-3 генов, а по экспрессии всех генов, отвечающих за реализацию данного биологического процесса. Это возможно при оценке полного транскриптома или при помощи тщательно подобранных панелей генов.

В настоящее время в методах исследования биологических объектов, в частности в методах, связанных с иммунологическими исследованиями, происходят революционные изменения в связи с появлением различных омиксных технологий анализа единичных клеток ex situ и технологий пространственной транскриптомики in situ. На протяжении десятилетий отлично зарекомендовали себя многие методы иммуноанализа: иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющий оценить продукцию цитокинов; ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), позволяющая провести анализ дифференциальной экспрессии генов, а также проточная цитометрия, позволяющая провести профилирование поверхностного протеома исследуемой клеточной популяции. Эти методы охватили три основные области исследования в иммунологии: секретомику, транскриптомику и протеомику. Каждая из них впоследствии получила свое развитие, преодолевающее имеющиеся недостатки основополагающих методов.

Так, транскриптомика получила продолжение в массовой транскриптомике путем секвенирования РНК (RNA-seq) или визуализации РНК при помощи флуоресцентных зондов (NanoString Sprint, NanoString, США), способной к одновременному анализу экспрессии от десятков до десятков тысяч генов вместо анализа экспрессии 3-5 генов методом ОТ-ПЦР. Однако, массовая транскриптомика была ограничена дорогими и трудоемкими методами выделения целевых популяций: для обогащения суспензии клеток используются клеточные сортеры, отделяющие целевые популяции на основе ограниченного набора флуоресцентных меток [1], или магнитная сепарация, ограниченная наличием одного уникального маркера на клеточной поверхности [2]. Для исследования срезов тканей применяется лазерная микродиссекция, при использовании которой не всегда можно точно выделить границы исследуемой ткани [3], или фоторасщепление молекулярных зондов под контролем экспрессии поверхностных белков (прибор NanoString GeoMX, NanoString, США) [4]. Кроме трудоемкости и дороговизны, эти методы всегда сопровождали выделение целевых клеток контаминацией нецелевыми клетками и общим падением жизнеспособности клеточной популяции, что влияло на конечный результат исследования. Преодолеть ограничения массовой транскриптомики в сфере получения чистых популяций помогла single-cell-революция - выход в 2017 г. в коммерческое производство приборов для анализа РНК единичных клеток BD Rhapsody (BD Biosciences, США) и 10X Genomics Chromium (10X Genomics, США).

Новые технологические возможности проточных цитометров (спектральная проточная цитометрия и цитометрия по времени пролета) и секвенирование протеома единичных клеток методом CITE-seq (клеточное индексирование транскриптомов и эпитопов), доступное для платформ BD Rhapsody и 10X Genomics Chromium, позволили опередить проточную цитометрию в анализе протеома единичных клеток за счет возможности анализа десятков и сотен белковых маркеров вместо 3-10 в случае использования обычного проточного цитометра [5].

Секретомика получила развитие в методах LegendPlex и BioPlex, способных к анализу десятков цитокинов в одном анализе в сравнении с ИФА, способного к анализу только одного цитокина. Однако, как и массовая транскриптомика, эти секретомные анализы зависят от чистоты выделения исследуемой клеточной популяции. Как и для массовой транскриптомики, секвенирование РНК единичных клеток позволило решить проблему чистоты исследуемой популяции при оценке клеточного секретома с помощью метода SEC-seq (секвенирование единичных клеток с кодируемой секрецией), в котором единичные клетки заключаются в микросферы в виде полулуний, способных удерживать в себе единичные клетки и связывать продуцируемые ими цитокины. Для детекции продукции цитокинов единичными клетками поверхность микросфер покрывают первичными антителами против целевых цитокинов, удерживающие цитокины внутри микросфер, а затем добавляют вторичные антитела против цитокинов, которые используются для приготовления библиотек методом CITE-seq [6].

Вслед за single-cell-революцией от компании 10X Genomics в 2019 г. последовала следующая - пространственная транскриптомика 10X Genomics Visium, коммерческая реализация технологии Spatial Transcriptomics, позволяющая проводить секвенирование in situ свежезамороженных и заключенных в парафин образцов и используемая для определения пространственного расположения целевых транскриптов в исследуемых тканях.

Сравнение основных молекулярно-биологических методов, применяемых в иммунологии, представлено в табл. 1.

Секвенирование единичных клеток

Метод секвенирования единичных клеток решил большинство проблем массовой транскриптомики и протеомики за счет изменения процесса пробоподготовки: вместо выделения отдельных клеточных популяций в прибор загружается суспензия клеток, получаемая простыми методами (центрифугирование в градиенте плотности и фильтрация); происходит физическая сепарация единичных клеток (каждая клетка попадает в индивидуальный микроколодец - BD Rhapsody, или клетки заключаются в липидные капли - 10X Genomics Chromium); к клеткам добавляются штрихкодирующие бусы (магнитные бусы с поли-Т-хвостами - BD Rhapsody; гелевые бусы с поли-Т-хвостами - 10X Genomics Chromium); проводится лизис единичных клеток в их изолированных компартментах; поли-А-молекулы связываются с бусами; к бусам добавляют реагенты для обратной транскрипции и на основе полученной кДНК готовится NGS-библиотека для секвенаторов Illumina (США). Полученные в результате секвенирования сырые прочтения после первичной обработки данных формируют матрицы экспрессии (клетка × ген), где для каждого гена указано количество копий обнаруженных транскриптов. Разделение клеток между собой достигается за счет наличия на каждом поли-Т-хвосте штрихкодирующих бус уникальных клеточных индексов (Cell Label), что позволяет причислить все прочтения, несущие один и тот же клеточный индекс, к одной клетке. Обнаружение именно транскриптов, а не просто прочтений на ген, обеспечивается наличием на каждом поли-Т-хвосте штрихкодирующих бус уникальных молекулярных идентификаторов (UMI), которые в процессе обработки данных позволяют коллапсировать прочтения, пришедшиеся на один транскрипт, в одну молекулу и тем самым подсчитать количество копий мРНК для каждого гена. Разделение клеток на популяции происходит методами биоинформатики при помощи библиотек Seurat [5] и ScanPy [7] языков программирования R и Python 3 соответственно: матрица данных экспрессии подвергается SCTransform-нормализации или log-нормализации, а затем анализу методами изучения больших данных - снижению размерности и кластерированию. Для наиболее вариабельных генов (2000-3000 генов при исследовании полного транскриптома) после нормализации данных проводят анализ по методу главных компонент (Principal Component Analysis - PCA). Затем проводят нелинейное снижение размерности Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP; Приближение и проекция равномерного многообразия) с использованием первых 20-30 главных компонент, которое позволяет отразить на двумерном графике единичные клетки с учетом их различий в экспрессии генов. После этого происходит обнаружение клеток-соседей (клеток со схожим профилем экспрессии) и их кластерирование методами Louvain или Leiden, что позволяет выявить отдельные клеточные кластеры. Обнаруженные кластеры затем идентифицируются как конкретная клеточная популяция по специфическому набору генов (рис. 1). Процесс биоинформатического выделения кластеров является намного более быстрым, чистым и стандартизованным. Он лишен вышеописанных недостатков приборов и методов выделения, однако требует наличия в научном коллективе специалиста по работе с большими данными.

Секвенирование РНК единичных клеток

Среди методов секвенирования единичных клеток наиболее частым является анализ их РНК - он позволяет дать ответ на многие вопросы при помощи комплекса методов, которые были детально рассмотрены в статье "Возможности комплексного анализа данных секвенирования РНК единичных клеток" [8].

Самым частым сценарием является анализ дифференциальной экспрессии генов между двумя состояниями (контрольная популяция и целевая популяция). Так как в процессе пробоподготовки загружается суспензия клеток одного или нескольких образцов (для BD Rhapsody требуется использование штрихкодирующих антител Sample Tag для одновременного исследования 2-12 образцов), анализ дифференциальной экспрессии генов проводится отдельно для каждой клеточной популяции (например, анализ клеток периферической крови позволяет провести одновременный анализ более десятка популяций). Полученный список генов с различной экспрессией для каждой исследуемой клеточной популяции затем можно проанализировать при помощи библиотек ClusterProfiler [9] и GSEApy [10] языков программирования R и Python 3 соответственно на предмет молекулярных сигнатур базы данных Gene Ontology, что позволяет определить активированные и подавленные биологические процессы в каждой исследованной клеточной популяции.

Выбор платформы для секвенирования РНК единичных клеток является ключевым шагом, зависящим от целей исследования. BD Rhapsody и 10X Genomics Chromium представляют собой две основные альтернативы, каждая обладает своими уникальными характеристиками. Так, BD Rhapsody больше подходит для чувствительных к воздействиям клеток и архивных образцов с низкой жизнеспособностью, так как в ее основе лежит технология микрофлюидики низкого давления и гравитации. Также она имеет более низкий порог необходимой жизнеспособности образцов, нежели 10X Genomics Chromium (50 и 80 % живых клеток соответственно). Для платформы BD Rhapsody также была показана бóльшая пригодность для секвенирования клеток иммунной системы, нежели для платформы 10X Genomics Chromium - BD Rhapsody позволяет обнаружить значительно больше транскриптов на клетку, что является критически важным параметром при исследовании клеток иммунной системы, имеющих низкое количество транскриптов.

В свою очередь, 10X Genomics Chromium эффективен для анализа крупных клеток, например некоторых опухолевых, эпителиальных и мышечных, которые плохо помещаются в микроколодцы картриджа BD Rhapsody. Он также более пригоден для полнотранскриптомного исследования, так как способен обнаруживать больше генов [11], особенно с использованием метода Gene Expression Flex, основанного на технологии молекулярных зондов с многократным покрытием каждого транскрипта [12].

Метод секвенирования РНК единичных клеток в свою очередь подразделяется на секвенирование полного транскриптома, таргетное секвенирование РНК и полноизоформное секвенирование РНК единичных клеток.

Секвенирование полного транскриптома единичных клеток

Секвенирование полного транскриптома - самый распространенный метод секвенирования РНК единичных клеток. Он призван комплексно изучить экспрессию генов в исследуемых образцах. Например, этим методом был проведен анализ самого известного набора данных единичных клеток - анализ клеток периферической крови человека, использующийся во вводном руководстве Seurat "Guided Clustering Tutorial" - вратах в мир единичных клеток для большинства исследователей. На его основе также недавно был составлен атлас иммунного ответа популяций иммунной системы мыши на 86 индивидуальных цитокинов, для которого был создан инструмент Immune Response Enrichment Analysis (IREA). Последний позволяет оценить влияние цитокинов на исследуемую клеточную популяцию по списку генов с повышенной экспрессией и применим даже для методов массовой транскриптомики [13].

Само по себе исследование полного транскриптома одновременно является и преимуществом, так как позволяет оценить целевые клетки без предварительной информации (именно так можно найти маркеры для дальнейшего прицельного анализа), так и недостатком - при полнотранскриптомном исследовании множество прочтений попадает на митохондриальные гены, гены общего обмена и другие гены, не связанные с иммунными процессами, что требует больших затрат на секвенирование. При полнотранскриптомном секвенировании с низкой глубиной прочтения возможна потеря данных о низкокопийных транскриптах, которая может исказить результаты анализа.

Таргетированное секвенирование РНК единичных клеток

Недостатки полнотраскриптомного секвенирования РНК привели к созданию таргетированного секвенирования РНК единичных клеток. Таргетные панели позволяют изучать целевые клетки с большей глубиной прочтения целевых генов, список которых был получен в результате предыдущего полнотранскриптомного анализа тех же клеток, выполненного методом RNA-seq или scRNA-seq. Этот подход также позволяет существенно снизить стоимость секвенирования за счет уменьшения необходимого количества прочтений в 5 раз (с 50 до 10 тысяч прочтений на клетку), вызванного снижением количества исследуемых генов, при этом сохранив и даже повысив глубину секвенирования. Также возможно увеличить специфичность обнаружения транскриптов благодаря использованию метода полугнездовой ПЦР в процессе приготовления библиотек вместо случайного праймирования транскриптов. Это делает метод таргетированного секвенирования РНК единичных клеток более пригодным для детекции минорных популяций и генов с низкой копийностью. Так, для BD Rhapsody существуют 2 важные для иммунологии панели: для изучения Т-клеток - T Cell Expression Panel (259 генов, человек) и для изучения иммунного ответа в целом - Immune Response (397 генов, человек или мышь). Нами успешно применен подход таргетированного секвенирования РНК единичных клеток для исследования иммунного транскриптома эритроидных клеток костного мозга здоровых доноров, позволивший обнаружить новую иммунорегуляторную субпопуляцию эритроидных клеток, экспрессировавшую генную сигнатуру противомикробного ответа [14].

Полноизоформное секвенирование РНК единичных клеток

Однако на полнотранскриптомном анализе single-cell-революция не остановилась. Полнотранскриптомный анализ единичных клеток не давал информации об изоформах исследуемых транскриптов, в частности - регуляторных цитокинов, что особо важно как для фундаментальной, так и для клинической иммунологии. Цитокины и их рецепторы имеют множество изоформ, образующихся при помощи альтернативного сплайсинга, альтернативных промоторов и различных сайтов полиаденилирования, в результате чего образуются белки с различной функциональной активностью, а порой и вовсе противоположной друг другу в контексте одного гена [15]. Эту проблему решил инструмент Seek One DD компании SeekGene (КНР), а именно его революционный протокол приготовления полноразмерных транскриптов, даже не имеющих поли-А-хвоста - scFAST-seq. Принципиально и конструктивно Seek One DD копирует прибор 10X Genomics Chromium. Также недавно появились протоколы секвенирования полноразмерных транскриптов для платформы 10X Genomics Chromium, где секвенирование финальных библиотек происходит на секвенаторах PacBio (PacBio, США) методом MAS-Seq или на секвенаторах Oxford NanoPore (Великобритания) вместо секвенаторов Illumina (США), однако такие подходы имеют более высокую стоимость в сравнении с scFAST-seq и приспособлены только для поли-А-молекул.

Исследование полноразмерных транскриптов позволяет перейти на принципиально новый уровень понимания альтернативного сплайсинга и его влияния на иммунные процессы. В настоящее время возможности исследования полноразмерных транскриптов только входят в практику исследователей из-за своей дороговизны и еще не нашли отражения в публикациях, однако демонстрационные данные scFAST-seq для мононуклеаров периферической крови здоровых взрослых доноров уже можно найти на сайте компании-производителя (https://www.seekgene.com/dataset, Dataset 3, доступ от 09.05.2024).

Мультиомика единичных клеток

Платформы BD Rhapsody и 10X Genomics Chromium также пригодны для исследования протеома единичных клеток. Для этого используется технология CITE-seq (cellular indexing of transcriptomes and epitopes - клеточное индексирование транскриптомов и эпитопов), которая позволяет одновременно проводить анализ полного транскриптома и поверхностных белков (обе платформы), а также внутриклеточных белков (только BD Rhapsody). Для BD Rhapsody используются антитела AbSeq (BD Biosciences, США), для 10X Genomics Chromium - антитела TotalSeq A, B, или C, которые объединены групповым названием Antibody-Derived Tag (ADT; полученные от антител метки) (Biolegend, США), Анализ протеома единичных клеток имеет свои отличия от анализа данных транскриптома на стадии нормализации - вместо log-нормализованых значений используется Centered log-ratio (центрированное логарифмическое соотношение) нормализация прочтений ADT.

Мультиомика единичных клеток объединяет анализ транскриптома и протеома, позволяя получить комплексное представление о состоянии клетки. Одновременный анализ транскриптома и протеома упрощает клеточное типирование с использованием стандартных иммунологических маркеров, а также позволяет сравнить результаты CITE-seq с результатами проточной цитометрии при использовании одних и тех же клонов антител. Одновременный анализ транскриптома и доступных для транспозазы сайтов ДНК позволяет провести корреляцию между доступностью хроматина и фактической экспрессией генов. Стандартом для анализа мультиома единичных клеток является метод Weighted Nearest Neighbours (WNN; метод взвешенных ближайших соседей) библиотеки Seurat, который заключается в поиске мультимодальных соседей (клеток со схожим транскриптомом и протеомом) и в мультимодальном снижении размерности WNN UMAP.

Особо важно применение CITE-seq в анализе гематологических онкологических заболеваний, где секвенирование мультиома единичных клеток позволяет изучить и транскриптом, и поверхностный протеом опухолевого клона, давая целостное понимание о природе опухоли и открывая простор для поиска новых мишеней для терапии [16, 17].

Мультиомика единичных клеток - секвенирование Т- и В-клеточных рецепторов

Для онко- и инфекционной иммунологии одной из важных задач является анализ клонотипов Т-клеточных рецепторов (TCR) и В-клеточных рецепторов (BCR), который помогает оценить эффективность и активность приобретенного иммунитета. Так, анализ TCR и BCR позволяет создавать перспективные CAR (Chimeric Antigen Receptor, Химерный антигенный рецептор, основанный на BCR) и TCR для Т-клеточной терапии [18,19]. Массовая транскриптомика плохо подходит для анализа Т- и В-клеточных рецепторов, так как пробоподготовка и анализ данных не позволяют собрать валидные пары α- и β-цепей Т- и В-клеточных рецепторов, поскольку в массовой транскриптомике отсутствует информация о ко-экспрессии транскриптов в клетке. Мультиомный анализ Т- и В-клеточных рецепторов единичных клеток возможен как на платформе BD Rhapsody, так и на платформе 10X Genomics Chromium вместе со всеми вышеперечисленными видами анализа - секвенирование РНК единичных клеток и анализ протеома единичных клеток. Так, анализ Т-клеточных рецепторов единичных Т-клеток вместе с использованием реактивов dCODE Dextramer (декстран, несущий на себе комплексы целевой пептид-MHC I класса) (Immudex, Дания) позволил выявить наиболее экспонированные клоны антиген-специфических Т-клеток и оценить в них экспрессию генов противовирусного ответа [20]. Наш коллектив разработал инструмент TCRscape, способный одновременно оценить фенотип антиген-специфических TCR-T-клеток, полученных при помощи инструмента BD Rhapsody, а также найти и подсчитать их клонотипы с целью найти доминантный клонотип (https://github.com/Perik-Zavodskii/TCRscape, доступ от 19.05.2024).

Сравнение вышеописанных платформ для анализа мультиома единичных клеток представлено в табл. 2.

Мультиомика единичных клеток - CyTOF и спектральная проточная цитометрия

Последние технологические усовершенствования в цитометрии, такие, как Cytometry by Time Of Flight (CyTOF; Цитометрия по времени пролета) и спектральная проточная цитометрия, наконец позволили методу цитометрии стать полноценным омиксным методом. Если ранее исследователи были крайне ограничены в выборе меток для одновременного анализа клеток (3-10 маркеров), то теперь метод стал пригоден для исследования 20-50 белковых маркеров для каждой единичной клетки. Метод CyTOF является приложением масс-спектрометрии к цитометрии: помеченная антителами, конъюгированными с изотопами тяжелых металлов (могут быть использованы 38 изотопов лантаноидов, 2 изотопа индия, 1 изотоп иттрия, 6 изотопов палладия и 1 изотоп висмута), сгорая, клетка формирует ионное облако, анализируемое масс-спектрометром по времени пролета. Содержание ионов конвертируется в интенсивность сигнала и формируется стандартная Flow Cytometry Standard (FCS) матрица экспрессии маркеров [21].

Спектральная проточная цитометрия является усовершенствованием метода проточной цитометрии, заключающимся в значительном увеличении количества детекторов, что обеспечивает возможность проводить сбор полного спектра эмиссии флуорохромов. Захват полного спектра эмиссии позволяет применить технику спектрального устранения смешения сигнала (spectral unmixing), заменяющую собой компенсацию в обычной проточной цитометрии, и как получить четкий сигнал от каждого исследованного флуорохрома, так и расширить список флуорофоров, возможных для исследования [22].

Именно метод высокомультиплексной цитометрии позволил выявить молекулярные сигнатуры иммунных клеток при COVID-19 за счет количества исследуемых маркеров [23].

Пространственная транскриптомика

Технологии анализа единичных клеток идеальны для анализа клеток в суспензии (например, как клеток крови или костного мозга), однако при анализе солидных органов даже эти методы приводят к частичной потере информации о взаимном расположении единичных клеток в пространстве и изменению экспрессии генов выделяемых клеток вследствие самого процесса выделения. Решением этой проблемы стали методы секвенирования in situ: 10X Genomics Visium и STOmics Stereo-seq, для которых полностью исключаются трудности выделения необходимых клеточных популяций и которые наиболее полно сохраняют анализируемые клетки в изначальном состоянии. Оба метода заключаются в следующем: срез ткани (замороженной в OCT или заключенной в парафин) помещают на микрочип, покрытый множеством ДНК-зондов, объединенных в кластеры, формирующие пространственные точки. На каждом ДНК-зонде, подобно улавливающим бусам для секвенирования РНК единичных клеток, присутствуют молекулярные штрихкоды, ответственные за пространственное расположение и уникальные молекулярные идентификаторы (UMI). После помещения среза на чип ткань фиксируют, окрашивают гематоксилином и эозином, проводят микроскопическое исследование, а затем добавляют лизирующий раствор, высвобождая транскрипты из клеток среза. Высвобожденные транскрипты связываются с ДНК-зондами, к ним добавляются реагенты для обратной транскрипции, на основе полученной кДНК готовится NGS-библиотека для секвенаторов компании Illumina (10X Genomics Visium) или компании BGI (КНР) (STOmics Stereo-seq). Затем сырые данные прочтений обрабатывают и формируют матрицы данных, содержащие информацию для каждого пространственного кластера ДНК-зондов о пространственных координатах и количестве транскриптов каждого гена.

Полученные матрицы вместе с изображением окрашенного гематоксилином и эозином среза ткани можно проанализировать в библиотеке Seurat [5] и SquidPy [24] языков программирования R и Python 3 соответственно, где данные проходят тот же путь анализа, что и при анализе данных единичных клеток: нормализация, снижение размерности PCA, снижение размерности UMAP, поиск соседей и кластеров, которые при анализе данных пространственной транскриптомики также можно визуализировать непосредственно на изображении среза ткани in silico. Это открывает возможности для понимания взаимодействия клеточного микроокружения при помощи биоинформатического инструмента CellChat, анализирующего лиганд-рецепторные взаимодействия на основании экспрессии генов [25] (рис. 2).

Пространственная транскриптомика 10X Genomics Visium существует в нескольких вариантах - Visium и Visium HD (high definition): первый имеет расстояние 50 мкм между двумя пространственными кластерами ДНК зондов, а второй - 2 мкм и дополнительно требует для пробоподготовки прибор CytAssit (10X Genomics, США) (Visium также доступен для прибора CytAssit). Так как средний размер клетки - 6-10 мкм, только Visium HD имеет разрешающую способность на уровне единичных клеток. Пространственная транскриптомика STOmics Stereo-seq существует только в высоком разрешении и имеет еще большую разрешающую способность, чем даже Visium HD - 500 нм, не требуя при этом отдельного прибора для пробоподготовки.

При помощи данных технологий активно проводится исследование опухолевого микроокружения, а также исследования биологии развития. Так, в работе Л.А. Таширевой и соавт. успешно проведено профилирование опухолевого микроокружения рака молочной железы при помощи технологии Visium [26], а технологию STOmics Stereo-seq с ее непревзойденной разрешающей способностью использовали для создания впечатляющих пространственно-временных полнотранскриптомных атласов органогенеза мыши - Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis (MOSTA) (https://db.cngb.org/stomics/datasets/STDS0000058, доступ от 09.05.2024) [27] и эмбриогенеза рыб Danio rerio - Spatiotemporal transcriptomic atlas of zebrafish embryogenesis (ZESTA) (https://db.cngb.org/stomics/datasets/STDS0000057, доступ от 09.05.2024) [28].

Пространственная мультиомика

Технологии пространственной мультиомки Visium и Stereo-seq в настоящее время находятся в состоянии бурного развития. Недавно они пополнились пространственной протеомикой при помощи ADT - технологией Spatial CITE-seq. Для Visium на данный момент существует одна панель - Human Immune Cell Profiling Panel (Biolegend, США), включающая 30 антител TotalSeq-Bn и предназначенная для анализа опухолевого микроокружения, которая, как и Visium HD, для пробоподготовки требует Visium CytAssit [29].

Spatial CITE-seq также скоро станет доступен и для технологии Stereo-seq. Анонсирована возможность одновременного анализа более 100 поверхностных и внутриклеточных белков вместе с полнотранскриптомным анализом (https://en.stomics.tech/products/Stereo-CITE-Solution/, доступ от 09.05.2024), однако по использованию данной технологии пока нет опубликованных статей.

Сравнение методов пространственной транскриптомики представлено в табл. 3.

Будущее пространственной мультиомики и мультиомики единичных клеток

Будущее мультиомики единичных клеток заключается в профилировании как можно большего количества модальностей за 1 раз для каждой изучаемой единичной клетки. Уже сейчас для Т-клеток возможно одновременно профилировать полный транскриптом, последовательность Т-клеточного рецептора, его антигенную специфичность, поверхностные и внутриклеточные белки; а в скором времени можно ожидать анализ метаболомики, липидомики и других омиксных модальностей.

Другой важный аспект - ускорение вычислений, связанных с анализом единичных клеток и пространственной транскриптомикой. Выравнивание множества прочтений на референсный геном или панель генов - самый долгий этап всего процесса обработки сырых данных секвенирования единичных клеток и пространственной транскриптомики. Он может быть ускорен на порядки при использовании квантовых компьютеров и соответствующих квантовых алгоритмов выравнивания прочтений [30, 31].

Заключение

Анализ единичных клеток открывает перед иммунологами бескрайние просторы для исследования нормальных и патологических иммунных процессов, а пространственная транскриптомика позволяет раскрыть сложности взаимодействия микроокружения в центральных и периферических органах иммунной системы, а также при опухолевых процессах. Эти методы на несколько порядков увеличивают точность, качество и объем получаемой информации о функциональной активности иммунокомпетентных клеток и об изучаемом иммунологическом процессе. Чтобы успеть воспользоваться преимуществами технологий анализа единичных клеток для собственных исследований в быстроразвивающемся глобализирующемся мире, от научных коллективов потребуется не только нарастить уровень технического оснащения, но и изучить современные биоинформатические инструменты, такие, как Seurat или ScanPy/SquidPy, основанные на работе с большими данными, освоение которых подразумевает изучение языков программирования R и Python 3.

Литература

1. Cossarizza A., Chang H.D., Radbruch A., Abrignani S., Addo R., Akdis M., Andrä I., Andreata F., Annunziato F., Arranz E., Bacher P. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. Eur. J. Immunol. 2021; 51 (12): 2708-3145. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.202170126

2. Miltenyi S., Müller W., Weichel W., Radbruch A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 1990; 11 (2): 231-8. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.990110203

3. Rabien A., Kristiansen G. Tissue microdissection. Cancer Gene Profiling: Methods and Protocols. 2016: 39-52. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3204-7_2

4. Hernandez S., Lazcano R., Serrano A., Powell S., Kostousov L., Mehta J., Khan K., Lu W., Solis L.M. Challenges and opportunities for immunoprofiling using a spatial high-plex technology: the NanoString GeoMx^® digital spatial profiler. Frontiers Oncol. 2022; 12: 890410. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2022.890410

5. Hao Y., Hao S., Andersen-Nissen E., Mauck W.M., Zheng S., Butler A., Lee M.J., Wilk A.J., Darby C., Zager M., Hoffman P. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 2021; 184 (13): 3573-87. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.04.048

6. Udani S., Langerman J., Koo D., Baghdasarian S., Cheng B., Kang S., Soemardy C., de Rutte J., Plath K., Di Carlo D. Associating growth factor secretions and transcriptomes of single cells in nanovials using SEC-seq. Nat. Nanotechnol. 2024; 19 (3): 354-63. DOI: https://doi.org/10.1038/s41565-023-01560-7

7. Wolf F.A., Angerer P., Theis F.J. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome biol. 2018; 19: 1-5. DOI: https://doi.org/10.1186/s13059-017-1382-0

8. Khozyainova A.A., Valyaeva A.A., Arbatsky M.S., Isaev S.V., Iamshchikov P.S., Volchkov E.V., Sabirov M.S., Zainullina V.R., Chechekhin V.I., Vorobev R.S., Menyailo M.E. Complex Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Data. Biochemistry (Moscow). 2023; 88 (2): 231-52. DOI: https://doi.org/10.1134/S0006297923020074

9. Wu T., Hu E., Xu S., Chen M., Guo P., Dai Z., Feng T., Zhou L., Tang W., Zhan L.I., Fu X. clusterProfiler 4.0: A universal enrichment tool for interpreting omics data. The innovation. 2021; 2 (3): 100141. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.xinn.2021.100141

10. Fang Z., Liu X., Peltz G. GSEApy: a comprehensive package for performing gene set enrichment analysis in Python. Bioinformatics. 2023; 39 (1): btac757. DOI: https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btac757

11. Salcher S., Heidegger I., Untergasser G., Fotakis G., Scheiber A., Martowicz A., Noureen A., Krogsdam A., Schatz C., Schäfer G., Trajanoski Z. Comparative analysis of 10X Chromium vs. BD Rhapsody whole transcriptome single-cell sequencing technologies in complex human tissues. Heliyon. 2024; 10 (7): E28358. DOI: https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e28358

12. Janesick A., Shelansky R., Gottscho A.D., Wagner F., Williams S.R., Rouault M., Beliakoff G., Morrison C.A., Oliveira M.F., Sicherman J.T., Kohlway A. High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis. Nat. Communicat. 2023; 14 (1): 8353. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-43458-x

13. Cui A., Huang T., Li S., Ma A., Pérez J.L., Sander C., Keskin D.B., Wu C.J., Fraenkel E., Hacohen N. Dictionary of immune responses to cytokines at single-cell resolution. Nature. 2024; 625(7994): 377-84. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06816-9

14. Perik-Zavodskii R., Perik-Zavodskaia O., Shevchenko J., Denisova V., Alrhmoun S., Volynets M., Tereshchenko V., Zaitsev K., Sennikov S. Immune Transcriptome Study of Human Nucleated Erythroid Cells from Different Tissues by Single-Cell RNA-Sequencing. Cells. 2022; 11 (22): 3537. DOI: https://doi.org/10.3390%2Fcells11223537

15. Сенников С.В., Силков А.Н., Козлов В.А. Роль альтернативного сплайсинга генов цитокинов в формировании полиморфной структуры цитокиновой сети. Медицинская иммунология. 2001; 3 (3): 389-400.

16. Cadot S., Valle C., Tosolini M., Pont F., Largeaud L., Laurent C., Fournie J.J., Ysebaert L., Quillet-Mary A. Longitudinal CITE-Seq profiling of chronic lymphocytic leukemia during ibrutinib treatment: evolution of leukemic and immune cells at relapse. Biomarker research. 2020; 8: 1-3. DOI: https://doi.org/10.1186/s40364-020-00253-w

17. Perik-Zavodskii R., Perik-Zavodskaia O., Alrhmoun S., Volynets M., Shevchenko J., Nazarov K., Denisova V., Sennikov S. Single-cell multi-omics reveal stage of differentiation and trajectory-dependent immunity-related gene expression patterns in human erythroid cells. Front. Immunol. 2024; 15: 1431303. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2024.1431303

18. Кузнецова М.С., Терещенко В.П., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Курилин В.В., Алсаллум А., Алрхмун С., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Фенотипические и функциональные особенности генерированных in vitro TCR-Т-клеток, специфичных к опухоль-ассоциированному антигену NY-ESO-1. Иммунология. 2022; 43 (5): 536-47. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-536-547

19. Терещенко В.П., Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Курилин В.В., Алсаллум А., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Характеристика лимфоцитов с MAGE-A4-специфичным TCR-подобным CAR-рецептором in vitro. Иммунология. 2022; 43 (4): 401-11. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-401-411

20. Jacobsen K., Inekci D., Brix L. 30 Single cell multiomic profiling of the antigen-specific immune response using antigen specific dCODE Dextramer^®(RiO) reagents and BD^® AbSeq Reagents on the BD Rhapsody™ single-cell analysis system. J. Immunother. Cancer. 2022; 10 (Suppl 2): A1 -A1603. DOI: https://doi.org/10.1136/jitc-2022-SITC2022.0030

21. Iyer A., Hamers A.A., Pillai A.B. CyTOF^® for the Masses. Front. Immunol. 2022; 13: 815828. DOI: https://doi.org/10.3389%2Ffimmu.2022.815828

22. Sharma S., Boyer J., Teyton L. A practitioner’s view of spectral flow cytometry. Nature Methods. 2023 4: 740-3. DOI: https://doi.org/10.1038/s41592-023-02042-3

23. Geanon D., Lee B., Gonzalez-Kozlova E., Kelly G., Handler D., Upadhyaya B., Leech J., De Real R.M., Herbinet M., Magen A., Del Valle D. A streamlined whole blood CyTOF workflow defines a circulating immune cell signature of COVID-19. Cytometry Part A. 2021; 99 (5): 446-61. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.a.24317

24. Palla G., Spitzer H., Klein M., Fischer D., Schaar A.C., Kuemmerle L.B., Rybakov S., Ibarra I.L., Holmberg O., Virshup I., Lotfollahi M. Squidpy: a scalable framework for spatial omics analysis. Nature methods. 2022; 19 (2): 171-8. DOI: https://doi.org/10.1038/s41592-021-01358-2

25. Jin S., Guerrero-Juarez C.F., Zhang L., Chang I., Ramos R., Kuan C.H., Myung P., Plikus M.V., Nie Q. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature communications. 2021; 12 (1): 1088. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-021-21246-9

26. Tashireva L.A., Kalinchuk A.Y., Gerashchenko T.S., Menyailo M., Khozyainova A, Denisov E.V., Perelmuter V.M. Spatial profile of tumor microenvironment in PD-L1-negative and PD-L1-positive triple-negative breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 2023; 24 (2): 1433. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms24021433

27. Chen A., Liao S., Cheng M., Ma K., Wu L., Lai Y., Qiu X., Yang J., Xu J., Hao S., Wang X. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 2022; 185 (10): 1777-92. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.04.003

28. Liu C., Li R., Li Y., Lin X., Zhao K., Liu Q., Wang S., Yang X., Shi X., Ma Y., Pei C. Spatiotemporal mapping of gene expression landscapes and developmental trajectories during zebrafish embryogenesis. Dev. Cell. 2022; 57 (10): 1284-98. DOI: https://doi.org/10.1016/j.devcel.2022.04.009

29. Ben-Chetrit N., Niu X., Swett A.D., Sotelo J., Jiao M.S., Stewart C.M., Potenski C., Mielinis P., Roelli P., Stoeckius M., Landau D.A. Integration of whole transcriptome spatial profiling with protein markers. Nature Biotechnol. 2023; 41 (6): 788-93. DOI: https://doi.org/10.1038%2Fs41587-022-01536-3

30. Boev A.S., Rakitko A.S., Usmanov S.R., Kobzeva A.N., Popov I.V., Ilinsky V.V., Kiktenko E.O., Fedorov A.K. Genome assembly using quantum and quantum-inspired annealing. Scientific Reports. 2021; 11 (1): 13183. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-021-88321-5

31. Kösoglu-Kind B., Loredo R., Grossi M., Bernecker C., Burks J.M., Buchkremer R. A biological sequence comparison algorithm using quantum computers. Scientific Rep. 2023; 13 (1): 14552. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41086-5

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)