Оценка гемопоэтического химеризма у минипигов при индукции иммунной толерантности к васкуляризированному композитному аллотрансплантату

• Бриллиантова Варвара Витальевна
• Котский Михаил Андреевич
• Муравская Маргарита Павловна
• Ткачук Юлия Валерьевна
• Соколова Ольга Николаевна
• Бондаренко Анатолий Викторович
• Козлитина Ольга Владимировна
• Митин Александр Николаевич
• Дроков Михаил Юрьевич
• Варлачев Александр Валерьевич
• Донецкова Альмира Дмитриевна

Резюме

Введение. Количественное определение химеризма после аллогенной трансплантации костного мозга (аТКМ) - один из основных методов оценки приживления аллотрансплантатов (в том числе при трансплантации васкуляризированных композитных комплексов тканей - ВКА) от того же донора. Полный стабильный химеризм коррелирует с длительным приживлением донорских тканей. Многократные исследования химеризма в динамике необходимы для оценки эффективности трансплантации с возможностью последующей отмены иммуносупрессивной терапии.

Цель работы - оценить гемопоэтический химеризм у минипигов после аТКМ при индукции иммунной толерантности к ВКА.

Материал и методы. Исследование проводили на минипигах гибридах пород Визенау и Вьетнамской вислобрюхой. Химеризм исследовали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на "0", "+14", "+21" и "+30" дни с использованием набора реагентов COrDIS PIG (ООО "ГОРДИЗ", Россия). Анализ результатов ПЦР проводили методом капиллярного электрофореза с использованием автоматического генетического анализатора (ABI PRISM 3500, Thermo Fisher Scientific, США). Полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения GeneMapper (Thermo Fisher Scientific, США). Аллели оценивали по 15 микросателлитным маркерам для каждого образца крови минипига, высчитывали процентное содержание аллелей донора и реципиента при анализе химеризма.

Результаты. Было исследовано 9 пар экспериментальных животных (донор-реципиент). У 5 реципиентов на +30 сутки после аТКМ в аспирате костного мозга определялись только собственные аллели. У 4 реципиентов наблюдался смешанный донорский химеризм. Методика показала чувствительность не менее 5 % в модельном эксперименте. Погрешность определения зависит от количества взятых в анализ локусов и не превышает 10 % при содержании аллелей донора 50 % в исследуемом образце.

Заключение. Определение донорского химеризма у минипигов после аТКМ при индукции иммунной толерантности к ВКА продемонстрировало динамику приживления ТКМ и максимальную экспансию донорскими клетками костного мозга реципиента до 80-90 %. Метод определения химеризма с помощью STR-локусов обладает высокой чувствительностью и может быть использован в модельных экспериментах с минипигами.

Ключевые слова: аллогенная трансплантация костного мозга; гемопоэтический химеризм; короткие тандемные повторы; STR; минипиги

Введение

В настоящее время определение донорского химеризма является важным диагностическим показателем, позволяющим оценить эффективность проведенной аллогенной трансплантации костного мозга (аТКМ) при терапии онкогематологических заболеваний, аплазий кроветворения и врожденных иммунодефицитов [1, 2]. Определение типа кроветворения у больного после аТКМ имеет большое значение для изучения механизмов приживления и отторжения, посттрансплантационной толерантности, реакций "трансплантат против хозяина" (РТПХ) и "трансплантат против лейкоза" (РТПЛ). Важно не только обнаружение гемопоэтических клеток донора, но и оценка их количества по отношению к клеткам реципиента: снижение количества клеток донорского происхождения в периферической крови или костном мозге может свидетельствовать о рецидиве заболевания или отторжении аллотрансплантата.

Для исследования химеризма у пациентов после аТКМ используются цитогенетические методы, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), определение химеризма по Y-хромосоме, изучение аллотипов иммуноглобулинов, различий по системе AB0 и Rh-фактору [3]. Все эти методы имеют ряд преимуществ и недостатков (например, ограничения при использовании в случаях, когда между донором и реципиентом нет различий по полу или других индивидуальных особенностей хромосом, различий по группе крови и пр.). В последние годы для оценки гемопоэтического химеризма все шире используются молекулярно-генетические методы: технология рестрикции фрагментов линейного полиморфизма - restriction fragment length polymorphism, RFLP; использование в качестве мишени генетических последовательностей, отличающихся числом тандемных повторов - мини-сателлитов (variable number tandem repeats, VNTR: повторяющихся последовательностей ДНК размером от 10 до 70 пар нуклеотидов) и микросателлитов (коротких тандемных повторов - short tandem repeats, STR: последовательностей от 2 до 9 пар нуклеотидов); секвенирование нового поколения (next-generation sequencing - NGS); систему полиморфизмов класса Insertion/Deletion (биаллельный полиморфизм, характеризующийся присутствием или отсутствием последовательности длиной в 5-15 пар нуклеотидов) с детекцией методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [4-7].

Исследование химеризма с помощью VNTR и STR проводится методом ПЦР, при этом определение продукта амплификации может быть выполнено различными путями: с помощью гель-электрофореза (окраска этидиума бромидом), капиллярного электрофореза, обработки серебром, флуоресцентной окраски, авторадиографии.

Одним из наиболее распространенных методов определения химеризма является система STR-ПЦР с детекцией продукта амплификации при помощи капиллярного электрофореза. На основе этой методики существуют коммерческие наборы, зарегистрированные для клинического применения. Метод не требует большого количества исследуемого материала, позволяет оценивать химеризм количественно с чувствительностью до 2-5 % [8].

Число трансплантаций васкуляризированных композитных аллотрансплантатов (ВКА) в мире имеет тенденцию к росту после первой успешной трансплантации в 1998 г. [9]. Обычно источник ВКА - умерший донор, который чаще всего несовместим с реципиентом по генам главного комплекса гистосовместимости (МНС). При таких трансплантациях особенно важно развитие иммунной толерантности к трансплантату, которую можно индуцировать с помощью смешанного или полного гемопоэтического химеризма - состояния, при котором ВКА распознается как "свое" и не отторгается [10]. В настоящее время все больше биомедицинских исследований в области трансплантологии связано с попытками увеличить продолжительность и улучшить качество жизни реципиентов в отдаленный период после аллотрансплантации, "уйти" от тяжелой медикаментозной иммуносупрессии с помощью новых альтернативных подходов к созданию трансплантационной толерантности [11].

Разработки, апробированные на экспериментальных моделях крупных животных, служат промежуточным, связующим звеном перед внедрением новых эффективных методов лечения в клинике. В частности, исследования, проводимые на минипигах (экспериментальных животных, близких по своей анатомии и физиологии к человеку), помогают понять иммунологию индукции толерантности при аллотрансплантации с несовпадением по МНС, а также подобрать оптимальные малотоксичные для реципиента протоколы индукции толерантности с минимальным краткосрочным предварительным кондиционированием иммунодепрессантами.

Цель настоящей работы - оценка гемопоэтического химеризма с помощью анализа локусов, содержащих STR, у МНС-несовместимых минипигов после аллогенной трансплантации костного мозга при индукции иммунной толерантности к ВКА.

Материал и методы

Модель на лабораторных животных. Исследование проводилось на 18 МНС-несовместимых минипигах гибридах пород Визенау и Вьетнамской вислобрюхой в возрасте 4-8 мес массой до 30 кг, полученных из питомника лабораторных животных ООО "Кролинфо" (Россия). Все процедуры с экспериментальными животными проводили в соответствии с правилами лабораторной практики [12].

Кондиционирование минипигов проводили γ-облучением согласно схеме из статьи Lellouch A.G. и соавт. [13] с некоторыми изменениями: облучение всего тела (ТОТ, день "-2") и тимуса (ЛОТ, день "-1"), использование блокаторов костимуляции (абатацепт), такролимуса и моноклональных антител к IL-6R (рис. 1). Радиационное облучение животных осуществлялось на базе ФГБУ "НИЦ "Курчатовский институт" на установке ГУТ-200М (Россия).

Сразу после пересадки ВКА (фрагмента задней конечности) проводили аТКМ. Количество трансплантированных миелокариоцитов варьировало от 1 · 10⁸ до 1 · 10⁹ на 1 кг массы тела животного, жизнеспособность клеток была выше 98 % при окраске трипановым синим.

Химеризм определяли в образцах периферической крови животных и в аспиратах костного мозга. Забор материала производили в пробирки с ЭДТА до аТКМ и в течение 1 мес после аТКМ (на +14, +21 и +30 сутки).

Исследование химеризма. Выделение ДНК из крови минипигов проводили в соответствии с инструкцией к набору реагентов для выделения ДНК из клинического материала "ДНК-сорб-В" (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Концентрация полученной ДНК при измерении на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США) составила 25-70 нг/мкл.

Химеризм оценивали методом ПЦР с помощью набора реагентов COrDIS PIG (ООО "ГОРДИЗ", Россия) для молекулярно-генетической характеристики свиней с целью анализа родства и ДНК-индивидуализации животных на основе мультиплексного ПЦР-анализа 15 локусов, содержащих микросателлиты (STR - short tandem repeats, короткие тандемные повторы). 15 анализируемых STR-локусов составляют стандартную панель маркеров, рекомендованную Международным обществом генетики животных (International Society of Animal Genetics - ISAG): S0005, S0090, S0101, S0155, S0227, S0228, S0355, S0386, SW24, SW240, SW72, SW857, SW911, SW936 и SW951.

Характеристика локусов представлена в табл. 1. Все эти локусы представляют собой тандемные динуклеотидные повторы. Праймеры для ПЦР подобраны с учетом проведения амплификации всех 15 локусов в одной пробирке. Размер всех амплифицируемых ПЦР продуктов < 500 пар нуклеотидов (с учетом всех известных аллелей). Условия амплификации: 94 °С - 3 мин (95 °С - 10 с, 57 °С - 30 с, 68 °С - 60 с) - 35 циклов; 68 °С - 6 мин 30 с; 20 °С - хранение.

Результаты ПЦР анализировали методом капиллярного электрофореза с использованием автоматического генетического анализатора с лазер-индуцированной флуоресцентной детекцией (ABI PRISM 3500, Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с инструкцией, предоставляемой производителем. В наборе COrDIS PIG используется три флуоресцентных красителя, характеризующихся разными длинами волн эмиссии для возможности одновременной детекции в разных каналах флуоресценции. Праймеры мечены двумя флуоресцентными красителями, детектируемыми в каналах Blue, Green. Стандарт длины S550 мечен третьим флуоресцентным красителем и детектируется в отдельном канале Orange одновременно с продуктами ПЦР. Также каждая постановка содержала контрольный образец PIG7 (высокомолекулярная лиофилизированная ДНК свиньи с известным генотипом по всем исследуемым локусам). Для получения полного STR-профиля образца использовали 10 нг ДНК. Полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения GeneMapper 5 (Thermo Fisher Scientific, США).

Первый этап определения химеризма - подбор информативных маркеров в паре "донор-реципиент". Для этого анализировали STR-локусы в образце донора и в образце реципиента до аТКМ (табл. 1).

Благодаря стандарту длины S550 и контрольному образцу ДНК PIG7 определяли размеры продуктов амплификации. Программа GeneMapper 5 позволяет определить аллельные варианты для каждого маркера (рис. 2).

Каждому маркеру на электрофореграмме может соответствовать один или два ПЦР-продукта, что соответствует гомо- и гетерозиготному состоянию локуса. Разница в длине аллелей обычно кратна 2, что отражает различия в количестве динуклеотидных повторов. Для корректного определения генотипа необходимо учитывать природу статтеров.

Статтеры - побочные продукты амплификации микросателлитных маркеров. Для динуклеотидных маркеров, к которым относятся все локусы набора COrDIS PIG, типичны статтеры размером -2 п.н. по отношению к основному продукту.

После определения профиля аллелей STR в паре "донор-реципиент" выбирали те маркеры, в которых у реципиента есть аллель, которого нет у донора (информативные для реципиента), и маркеры, в которых у донора есть аллель, которого нет у реципиента (информативные для донора). В дальнейшем для исследования химеризма в образцах реципиента после трансплантации использовали не менее 2 маркеров, информативных для реципиента, и не менее 2 маркеров, информативных для донора.

Количественно химеризм (соотношение процентного содержания аллелей донора и реципиента в образцах реципиента после аТКМ) рассчитывался по соотношению высоты пиков на капиллярном электрофорезе в программе GeneMapper 5. Данные представлены в виде количества аллелей реципиента и аллелей донора в образце, в процентах. Полным донорским химеризмом считали наличие только донорских аллелей в образце после аТКМ при отсутствии определяемых аллелей реципиента (количество аллелей реципиента меньше порога чувствительности метода - 2-5 %). Смешанным химеризмом считали наличие в образце после аТКМ аллелей как донора, так и реципиента.

Результаты

Для оценки применимости метода был проведен эксперимент по определению воспроизводимости метода при определении химеризма. Для эксперимента смешивали образцы ДНК донора (минипиг № 104b) и ДНК реципиента (минипиг № 103b) для получения 5, 10, 15, 25 и 50 % ДНК донора в ДНК реципиента. Далее в полученных образцах со смешанной ДНК проводили измерение химеризма с помощью вышеописанной методики определения STR-маркеров набором COrDIS PIG (ООО "ГОРДИЗ", Россия) по трем локусам, информативным для донора (табл. 2).

Всего химеризм исследовали у 9 пар экспериментальных животных. Все реципиенты получили трансплантацию васкуляризированного трансплантата и аТКМ от донора, несовместимого по MHC. У 5 реципиентов на +30 сутки после аТКМ в периферической крови и аспирате костного мозга определялись только аллели реципиента, присутствие донорских аллелей не установлено. У 4 реципиентов определялись донорские аллели после аТКМ на +14, +21, +30 сутки (табл. 3).

У реципиента № 151 удалось проследить динамику изменения донорского химеризма в сроки от +7 до +34 суток от аТКМ. Динамика изменений представлена на рис. 3. К +20 суткам от аТКМ донорский химеризм составлял примерно половину всех аллелей в костном мозге реципиента и сохранялся на этом уровне до 34 сут.

Пример смешанного донорского химеризма представлен на рис. 4, а на рис. 5 показано полностью собственное кроветворение после аТКМ.

Если у донора и реципиента не было одинаковых аллелей в исследуемом локусе (пример: донор гомозиготен по аллелю b, реципиент гетерозиготен по аллелям c и d), процент содержания аллелей донора в образце рассчитывали по формуле:

где a - количество донорских аллелей в образце (в %); b - высота пика уникального донорского аллеля, который отсутствует у реципиента; с - высота пика первого аллеля реципиента; d - высота пика второго аллеля реципиента.

Если у донора и реципиента присутствовал один общий аллель в исследуемом локусе (пример: донор гетерозиготен по аллелям b и c, реципиент гетерозиготен по аллелям c и d), процент содержания аллелей донора в образце рассчитывали по формуле:

где a - это количество донорских аллелей в образце (в %); b - высота пика уникального донорского аллеля, который отсутствует у реципиента; с - высота пика аллеля реципиента, общего с донором; d - высота пика уникального аллеля реципиента, который отстутствует у донора. Когда у донора и реципиента есть общий аллель, значение b в числителе умножается на 2, чтобы учесть вклад в высоту пика общего аллеля примеси донора.

Обсуждение

Оптимальный способ предотвращения реакции отторжения аллотрансплантата - это индукция трансплантат-специфической толерантности реципиента с помощью гемопоэтических и/или мезенхимальных стволовых клеток донора [14, 15]. У человека перспективные протоколы индукции толерантности, основанные на применении гемопоэтических стволовых клеток костного мозга донора, изучаются главным образом при трансплантации почки [11]. Они обеспечивают длительную, чаще пожизненную иммунопривилегированность и функционирование почечного трансплантата без применения поддерживающей иммуносупрессивной терапии. Помимо трансплантации солидных органов, в настоящее время все чаще используется пересадка ВКА - трансплантация нескольких типов тканей (кожи, мышц, костей с кровеносными сосудами и нервами), обычно от МНС-несовместимых доноров [16]. Однако реципиенты ВКА вынуждены пожизненно принимать токсичные иммунодепрессанты со всеми вытекающими негативными последствиями искусственного иммунодефицита - онкологическими и инфекционными заболеваниями, органотоксичностью, снижающими качество и продолжительность их жизни.

Иммуносупрессивная терапия продлевает период функционирования трансплантата, однако в большинстве случаев не обеспечивает полной толерантности иммунной системы реципиента к трансплантированному органу. Следовательно, решение проблемы иммунологической несовместимости аллогенных органов и тканей при трансплантации способно качественно улучшить эффективность лечения ряда фатальных и инвалидизирующих заболеваний. Это возможно при развитии донорского химеризма после аТКМ от донора ВКА или целевого органа. Показано, что полный стабильный химеризм коррелирует с длительным приживлением донорских тканей [11]. Для формирования донорского химеризма представляется перспективным использование трансплантации гемопоэтических стволовых клеток с блокаторами костимуляции [17].

Таким образом, для понимания динамики приживления стволовых клеток у пациентов после аТКМ большое значение представляет исследование донорского гемопоэтического химеризма. В настоящей работе мы изучали формирование химеризма в ранние сроки после аллогенной трансплантации у МНС-несовместимых минипигов с помощью анализа локусов, содержащих STR. Процесс отторжения ВКА в таких случаях может происходить очень быстро, однако исследование уровня химеризма дает возможность принять меры к его предупреждению [11]. Уменьшение иммуносупрессии, назначение инфузии донорских клеток может способствовать переходу смешанного химеризма в полный.

Применение набора COrDIS PIG (ООО "ГОРДИЗ", Россия) для определения химеризма у минипигов в эксперименте было успешным и показало высокую чувствительность определения химеризма (до 5 % примеси ДНК донора в ДНК реципиента). Проведение анализа не менее, чем по трем информативным локусам дает возможность повысить точность количественного определения химеризма. Применение методики позволило наблюдать процесс формирования смешанного донорского химеризма у экспериментального животного в динамике на примере минипига № 151.

Следовательно, последовательный и многократный анализ химеризма показан при проведении иммуносупрессивной терапии как важный показатель состояния кроветворения.

Заключение

Количественное определение химеризма после аТКМ - это один из основных методов оценки возможности приживления аллотрансплантатов (в том числе ВКА) от того же донора. Многократные исследования химеризма в динамике необходимы для оценки эффективности трансплантации с возможностью последующей отмены иммуносупрессивной терапии. В настоящей работе была проведена оценка гемопоэтического химеризма у МНС-несовместимых минипигов после аТКМ при индукции иммунной толерантности к ВКА с помощью анализа STR-локусов методом ПЦР с детекцией микросателлитов (STR) с использованием капиллярного электрофореза.

Показаны высокая чувствительность метода и корреляция количественного значения химеризма с процессом приживления трансплантата костного мозга у реципиентов после аТКМ. Таким образом, изучение формирования химеризма у минипигов с одновременным проведением аТКМ и ВКА может проводиться методом анализа STR-локусов c использованием капиллярного электрофореза. Тем не менее, сама проблема создания иммунной толерантности к аллотрансплантату с помощью пересадки гемопоэтических стволовых клеток требует проведения дальнейших исследований.

Литература

1. Van Deerlin V.M., Leonard D.G. Bone marrow engraftment analysis after allogeneic bone marrow transplantation. Clinics in laboratory medicine. 2000; 20 (1): 197-225. PMID: 10702903

2. Блау О.В. Химеризм после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. 2013; 6 (1): 34-9. eLIBRARY ID: 22548238

3. Fehse B., Chukhlovin A., Kuhlcke K. et al. Real-time quantitative Y chromosome-specific PCR (QYCS-PCR) for monitoring hematopoietic chimerism after sex-mismatched allogeneic stem cell transplantation. J. Hematother. Stem. Cell Res. 2001; 10 (3): 419-25. DOI: https://doi.org/10.1089/152581601750289028

4. Blazar B., Orr H., Arthur D. et al. Restriction fragment length polymorphisms as markers of engraftment in allogeneic marrow transplantation. Blood 1985; 66: 1436-44. PMID: 2998513

5. Socie G., Lawler M., Gluckman E. et al. Studies on hematopoietic chimerism following allogeneic bone marrow transplantation in the molecular biology era. Leuk. Res. 1995; 19: 497-504. DOI: https://doi.org/10.1016/0145-2126(95)00026-k

6. Thiede F.C., Bornhaeuser M., Oesschlagel U. et al. Sequential monitoring of chimerism and detection of minimal residual disease after allogeneic blood stem cell transplantation (BSCT) using multiplex PCR amplification of short tandem repeat markers. Leukemia 2001; 7: 958-65. DOI: https://doi.org/10.1038/sj.leu.2401953

7. Liacini A., Tripathi G., McCollick A. et al. Chimerism Testing by Next Generation Sequencing for Detection of Engraftment and Early Disease Relapse in Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation and an Overview of NGS Chimerism Studies. Int. J. Mol. Sci. 2023; 24 (14): 11814. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms241411814

8. Abatay-Sel F., Savran-Oguz F., Kalayoglu-Besisik S. et al. Short Tandem Repeate-Polimerase Chain Reaction (STR-PCR) with Quantitative Ral-Time Polimerase Chain Reaction (qRT-PCR) Method using for Chimerism Analisys. Clin Lab. 2019; 65 (9). DOI: https://doi.org/10.7754/Clin.Lab.2019.190221

9. Dubernard J.M., Owen E., Herzberg G. et al. Human hand allograft: report on first 6 months. Lancet. 1999; 353 (9161): 1315-20. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(99)02062-0

10. Sachs D.H., Kawai T., Sykes M. Induction of tolerance through mixed chimerism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2014; 4 (1): a015529. DOI: https://doi.org/10.1101/cshperspect.a015529

11. Yang J.H., Johnson A.C., Colakoglu S., Huang C.A., Mathes D.W. Clinical and preclinical tolerance protocols for vascularized composite allograft transplantation. Arch. Plast. Surg. 2021; 48 (6): 703-13. DOI: https://doi.org/10.5999/aps.2021.00927

12. Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях" (ETS N123), приказ Минздравсоцразвития РФ от 23.08.2010 № 708н "Об утверждении правил лабораторной практики".

13. Lellouch A.G., Andrews A.R., Saviane G. et al. Tolerance of a Vascularized Composite Allograft Achieved in MHC Class-I-mismatch Swine via Mixed Chimerism. Front. Immunol. 2022; 13: 829406. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.829406

14. Kawai T., Sachs D.H., Sykes M., Cosimi A.B. HLA-Mismatched Renal Transplantation without Maintenance Immunosuppression. N. Engl. J. Med. 2013; 368 (19): 1850-2. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMc1213779

15. Бехало В.А., Горская Ю.Ф., Нестеренко В.Г. Иммунорегуляторный и иммунотерапевтический потенциал мезенхимальных стволовых/стромальных клеток: перспективы и проблемы. Иммунология. 2024; 45 (3): 385-95. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-3-385-395

16. Siemionow M.Z., Kulahci Y., Bozkurt M. Composite tissue allotransplantation. Plast. Reconstr. Surg. 2009; 124 (6 Suppl): e327-39. DOI: https://doi.org/10.1097/PRS.0b013e3181bf8413

17. Гринько Е.K., Донецкова А.Д., Варлачев А.В., Митин А.Н. Роль блокаторов костимуляции в трансплантологии: от эксперимента к клинике. Иммунология. 2023; 44 (3): 626-39. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-3-626-639

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)