Экспериментальная модель взаимодействия лигандов с рецепторами иммунных контрольных точек на примере PD1 и PD-L1

• Васильева Татьяна Викторовна
• Иванов Сергей Валерьевич
• Ушакова Екатерина Игоревна
• Аль Худур Сара Абдулхуссейн
• Лебедева Екатерина Семеновна
• Пичугин Алексей Васильевич
• Атауллаханов Равшан Иноятович

Резюме

Введение. Блокада рецепторов иммунных контрольных точек (immune checkpoint blockade, ICB) - это одно из эффективных направлений современной иммунотерапии пациентов со злокачественными новообразованиями. Клиницисты используют блокирующие антитела к рецепторным белкам PD1, PD-L1, LAG3, экспонированным на различных типах клеток, включая Т-, НК-, В-клетки, а также миелоидные клетки микроокружения и непосредственно злокачественные клетки опухоли. Широкий опыт применения ICB показал значительные различия в клинической эффективности различных препаратов и их комбинаций. Стала очевидной актуальная задача разработки широкого спектра новых препаратов для ICB. В свою очередь, для разработки новых чекпойнт-блокаторов требуются удобные и эффективные экспериментальные модели, с помощью которых можно было бы проводить скрининг существующих и вновь разработанных лекарственных веществ.

Цель. Данная работа посвящена разработке и детальному изучению двух экспериментальных моделей для обнаружения и характеристики новых чекпойнт-блокаторов.

Материал и методы. Для анализа блокады сигнальной оси PD1 → PD-L1 использованы трансдуцированные клетки линии HEK293-PD1, устойчиво экспрессирующие на своей поверхности рецепторный белок PD1. Одна из двух разработанных экспериментальных моделей исследует ингибирование взаимодействия растворимого рекомбинантного белка PD-L1-Fc, меченого биотином, с клетками линии HEK293-PD1. Во второй экспериментальной модели мы анализируем ингибирование взаимодействия меченого флуорохромом антитела к PD1 с клетками HEK293-PD1. Связывание меченых лигандов с клетками исследовали методом проточной цитофлуориметрии. Об ингибировании связывания судили по изменению интенсивности флуоресценции меченых клеток.

Результаты. В разработанных экспериментальных моделях исследованы блокирующие свойства терапевтических антител к PD1 и PD-L1, а также растворимых рекомбинантных белков PD-L1-Fc и PD1-Fc. Показана высокая чувствительность предложенных экспериментальных моделей, позволяющая не только установить наличие блокирующих свойств любого вещества на взаимодействие PD-L1 с PD1, но и определить удельную активность блокаторов PD-L1 и PD1 с полумаксимальной константой ингибирования (K₅₀) в области наномолярных концентраций исследуемого вещества. Авторы считают, что предложенный подход можно использовать для создания экспериментальных моделей с любыми клеточными рецепторами в качестве молекулярных мишеней ингибирования.

Ключевые слова: PD1-позитивная клеточная линия; растворимые PD1 и PD-L1; антитело; ингибирование; цитометрия

Введение

PD1 (от англ. programmed cell death 1, известен также как CD279) - белок-рецептор на поверхности Т- и В-клеток. Связывание лигандов с PD1 ингибирует активность лимфоидных клеток и может индуцировать их апоптоз. PD1 и его лиганды регулируют иммунные реакции и по этой причине PD1 относится к иммунным контрольным точкам [1-3].

PD-L1 (от англ. programmed cell death-ligand 1, известен также как CD274) - мембранный белок, лиганд рецептора PD1, экспонируется на поверхности активированных макрофагов и дендритных клеток, активированных Т- и В-клеток, а также на клетках многих других тканей. Взаимодействие PD-L1 с рецептором PD1 индуцирует в PD1-положительных клетках ингибирующий сигнал, что подавляет функционирование и размножение активированных Т- и В-клеток, а также может вызвать их апоптоз [4-6].

Белок PD-L1 на клетках злокачественных опухолей через воздействие на рецепторы PD1 ингибирует активность противоопухолевых Т-клеток. Блокирование взаимодействия PD-L1 с рецепторами PD1 с помощью антител к одной или сразу к обеим молекулам позволяет отменить иммуносупрессию, активировать противоопухолевые Т-клетки и называется блокадой иммунных контрольных точек (от англ. immune checkpoint blockade). Такая блокада с помощью терапевтических моноклональных антител к PD1 и PD-L1 успешно используется в последнее десятилетие для иммунотерапии пациентов с онкологическими заболеваниями [7-14].

Кроме PD1, на Т-клетках экспонируются и другие ингибирующие рецепторы, в частности CTLA-4, TIM-3, LAG-3, TIGIT и др. Разрабатываются новые лекарственные препараты, нацеленные на блокирование этих рецепторов для уменьшения иммуносупрессии у пациентов со злокачественными новообразованиями [9]. Показано, что разные блокаторы указанных чекпойнт-рецепторов проявляют разную эффективность при лечении пациентов с онкологическими заболеваниями. Кроме того, одновременное блокирование двух или более ингибирующих рецепторов позволяет достичь синергического эффекта при лечении [15, 16]. Эти знания побуждают исследователей и фармацевтические компании разрабатывать новые лекарственные препараты для терапевтической блокады ингибирующих рецепторов клеток иммунитета [17]. В этой связи возникает повышенная потребность в удобных для использования экспериментальных моделях, в которых можно было бы проводить скрининг и изучение новых чекпойнт-блокаторов.

В данной статье мы сообщаем о создании и апробации двух экспериментальных моделей для поиска и детального изучения блокаторов ингибирующих чекпойнт-рецепторов. В обеих моделях мы используем генетически модифицированную линию клеток HEK293 с устойчивой экспрессией PD1-рецепторов на клеточной поверхности (далее HEK293-PD1). Одна модель строится на взаимодействии меченого рекомбинантного растворимого лиганда PD-L1 с клетками HEK293-PD1. В другой модели в качестве основы используется взаимодействие меченых антител к PD1 с теми же клетками HEK293-PD1. В качестве контрольных клеток, лишенных PD1, мы использовали клетки дикого типа HEK293T. В работе описаны результаты количественного исследования пригодности указанных экспериментальных моделей для скрининга новых блокаторов взаимодействия PD1 c PD-L1. Представлены данные о специфичности и чувствительности предложенных экспериментальных моделей. Использованный в работе методический подход на примере блокирования PD1 и PD-L1 показывает, как можно создавать простые и чувствительные экспериментальные модели для других рецепторов иммунных контрольных точек.

Материал и методы

Получение линии клеток HEK293-PD1, экспрессирующих PD1 человека. Линию клеток HEK293T трансдуцировали вектором для экспрессии мембранной формы белка PD1 человека по методу Y. Fukumoto и соавт. [18] с некоторыми модификациями. РНК выделяли на колонках с использованием набора RNeasy Mini kit (Qiagen; США) из мононуклеаров крови человека, активированных иономицином и форболовым эфиром. Очищенную РНК использовали для синтеза обратной цепи кДНК при помощи ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit (NEB; США). кДНК амплифицировали с использованием высокоточной полимеразы Tersus ("Евроген", Россия) и праймеров PDCD1 XbaI dir (5'-tataTCTAGACTCCAGGCATGCAGATCCCACAG-3') и PDCD1 BamHI rev (5′-atatGGATCCTTAGATGACGGCCAGGACCCAGAC-3′). Ампликоны электрофоретически отделяли и очищали при помощи твердофазной экстракции, клонировали по сайтам рестрикции XbaI - BamHI (ферменты NEB, США) в лентивирусный экспрессионный вектор pLSFFV-PL4-puro (лигаза T4, "Евроген", Россия). Трансфекцию клеток HEK-293T проводили в среде Opti-MEM (Gibco, США). В культуру клеток HEK-293T вносили плазмиду pLSFFV-PDCD1-puro вместе с упаковывающими плазмидами psPAX2 и pMD2.G (Dr. Didier Trono, Addgene_12260, США). На следующий день среду заменяли на бессывороточную DMEM-F12 с добавлением Serum replacement solution и Lipid mixture (Peprotech, США) и 4 мМ кофеина (Sigma Aldrich, США). Через 48 ч обогащенную лентивирусом среду собирали, фильтровали и использовали для трансфекции свежих клеток HEK293T в присутствии полибрена (Sigma Aldrich, США). Через 72 ч для селекции трансфецированных клеток в культуральную среду добавляли 1 мкг/мл пуромицина (Sigma Aldrich, США) и продолжали культивировать клетки в течение 10 дней. Трансфецированные HEK293-PD1, экспрессирующие целевой ген PD1, поддерживали в культуре in vitro регулярными пассажами, как и клетки дикого типа.

Культивирование клеток линий HEK293T и HEK293-PD1. Клетки HEK293Т и HEK293-PD1 культивировали in vitro в полной культуральной среде (ПС), составленной из Advanced RPMI-1640 (Gibco, США) c добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, SV30160.03 Cytiva, GE Healthcare Life Sciences HyClone, США), 1× коктейля заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина

и 10 мкг/мл гентамицина (все реактивы ПанЭко, Россия), в чашках Петри, при 37 °C, в увлажненной атмосфере 5 % СО₂ в воздухе. Клетки пересевали, когда они занимали до 70-80 % поверхности. Для этого клетки снимали с пластика с помощью трипсина-ЭДТА, отмывали в фосфатном буфере с 0,5 % бычьего сывороточного альбумина (PBS-BSA, ПанЭко, Россия), помещали в ПС для нового пассажа, уменьшив концентрацию клеток в 10 раз.

Получение рекомбинантных белков PD1-Fc и PD-L1-Fc. Для получения белков PD1-Fс и PD-L1-Fс мы объединили последовательность внеклеточной части PD1 человека (Leu25-Gln167) и PD-L1 (Phe19-Thr167) с последовательностью Fс-фрагмента человеческого IgG1 (CH2-CH3-домены) через глицин-сериновый линкер (G₄S)₃. Нативные сигнальные пептиды PD1 и PD-L1 были заменены в составе рекомбинантных белков последовательностью сигнального пептида MGWSLILLFLVAVATRVLS. Синтез кодон-оптимизированных нуклеотидных последовательностей белков PD1-Fс и PD-L1-Fс для экспрессии в клетках CHO заказывали в компании Synbio Technologies (КНР) и клонировали в экспрессионный вектор pCDNA 3.1.

Транзиторную трансфекцию суспензионых клеток CHO-S (Large-scale transient transfection of suspension CHO-S cell) выполняли по методу D.J. Leahy и соавт. [19]. Для трансфекции клеточной линии CHO-S использовали линейный полиэтиленимин 25 кДа (Sigma-Aldrich, США) в весовом соотношении 3 : 1 к плазмидной ДНК. Затем клетки культивировали в бессывороточной среде HyClone SFM4CHO (Cytiva, США) в течение 5-7 сут при 37 °С и 5 % CO₂ и постоянном перемешивании при 130 об/мин на орбитальном шейкере. Процесс останавливали при снижении жизнеспособности клеток до 70-80 %.

Очистку рекомбинантных белков PD1-Fс и PD-L1-Fс проводили методом аффинной хроматографии на протеин А-сефарозе (GE Healthcare, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Целевой белок с колонки элюировали 0,1 М глициновым буфером (рН 3,5), полученные фракции нейтрализовали путем добавления 1 М Tris-HCl (pH 8,0) в соотношении 1 : 10 к объему глицинового буфера. Затем белок диализовали против фосфатно-солевого буфера pH 7,2 и концентрировали на центрифужных фильтрах Amicon Ultra - 15 (Merck-Millipore, США).

Многие злокачественные опухоли используют описанную выше естественную регуляцию адаптивных иммунных реакций для самозащиты от атаки Т-клеток. Для этого клетки опухоли экспонируют на своей поверхности большое количество молекул PD-L1. При контакте с такими защищенными клетками опухоли Т-клетки не способны выполнить свои противоопухолевые функции. Экспрессия молекул PD-L1 - это один из множества эффективных молекулярных механизмов избегания опухолью атаки иммунитета - явления, хорошо известного как tumor immune escape [2, 4, 10].

Блокаторы взаимодействия PD1 с PD-L1 отменяют описанную защиту опухолевых клеток от Т-клеточной атаки. Антитела, блокирующие PD1 или PD-L1, предотвращают ингибирование Т-клеток при их контакте с PD-L1-позитивными опухолевыми клетками или АПК. Исключается или уменьшается торможение противоопухолевой функции Т-клеток. Это полезное действие антител к PD1 и PD-L1 используется при лечении пациентов со злокачественными опухолями. Антитела к PD1 и PD-L1 представляют собой наиболее успешные варианты терапевтических антител в арсенале блокады иммунных контрольных точек (immune checkpoint blockade) [9].

Наряду с PD1 и PD-L1 на Т-клетках экспонируются и другие ингибиторные рецепторы, такие, как CTLA-4, LAG-3, TIGIT, TIM-3 и др. [17, 23]. Исследователи активно изучают роль этих ингибиторных рецепторов в регуляции противоопухолевого действия Т-клеток. Разрабатываются соответствующие лекарственные препараты для блокирования этих ингибиторных рецепторов. Терапевтические антитела, блокирующие CTLA-4, успешно используются в практике онкологов.

Исследование терапевтических антител, специфичных к PD1 или CTLA-4, показало, что эти два чекпойнт-блокатора имеют разные клеточные мишени. Блокаторы PD1 главным образом действуют на Т-клетки-эффекторы, а блокаторы CTLA-4 - на Т-клетки-регуляторы. Как следствие, различается терапевтическая эффективность анти-PD1- и анти-CTLA-4-антител при лечении пациентов со злокачественными новообразованиями.

Так, отдаленные результаты лечения паицентов с меланомой в III и IV стадиях ракового процесса показали, что через 6,5 лет после начала лечения медиана общей выживаемости (median overall survival) составила 36,9 мес в группе пациентов, лечившихся пембролизумабом (анти-PD1), против 19,9 мес в группе пациентов, получавшей терапию ипилимумабом (анти-CTLA-4).

Значительно более эффективной оказалась комбинация этих препаратов. В группе пациентов, лечившихся комбинацией [пембролизумаб + ипилимумаб] медиана общей выживаемости составила 72,1 мес [16]. Эти клинические результаты убедительно доказывают, что разные блокаторы рецепторов иммунных контрольных точек действуют с различной эффективностью при лечении пациентов со злокачественными опухолями. Комбинации разнонаправленных терапевтических блокаторов иммунных контрольных точек могут обладать существенными преимуществами по сравнению с одиночными препаратами. Следовательно, в арсенале онколога должно быть множество разных чекпойнт-блокаторов, нацеленных на разные молекулярные мишени и различающихся своими свойствами. Это, в свою очередь, означает, что необходимы удобные экспериментальные модели для разработки новых блокаторов иммунных контрольных точек. Наша работа, описанная в данной статье, как раз и посвящена разработке таких экспериментальных моделей.

Мы разработали и исследовали эффективность двух экспериментальных моделей. В одной из них блокаторы иммунных контрольных точек ингибировали взаимодействие растворимого лиганда PD-L1-Fc-biotin с рецептором PD1 на поверхности генетически модифицированных клеток HEK293-PD1 (см. рис. 2-4). В другой - ингибиторы препятствовали взаимодействию меченого анти-PD1-антитела с PD1-рецептором на клетках HEK293-PD1 (см. рис. 5 и 6).

Как было описано выше, в организме происходит регуляторное взаимодействие двух типов клеток - PD1-позитивных Т-клеток с PD-L1-позитивными АПК или PD1-позитивных Т-клеток с PD-L1-позитивными клетками злокачественной опухоли.

Создать экспериментальную модель двух взаимодействующих типов клеток непросто, еще сложнее учитывать влияние такого взаимодействия на Т-клетки и количественно определять действие чекпойнт-блокатора на функцию и выживаемость Т-клеток. Вместо модели взаимодействия PD1-позитивных Т-клеток с PD-L1-позитивными АПК или опухолевыми клетками мы создали гораздо более простые модели, в которых происходит взаимодействие меченого растворимого лиганда или антитела с PD1-рецепторами на генетически модифицированных клетках линии HEK293-PD1, которые устойчиво экспрессируют PD1 (см. рис. 1), и эти клетки легко поддерживать в культуре in vitro.

Эффективность и специфичность созданных нами моделей доказаны с помощью терапевтических чекпойнт-блокаторов, являющихся общепринятым "золотым стандартом" для блокады PD1 (пембролизумаб) или PD-L1 (атезолизумаб). Высокая чувствительность нашей экспериментальной модели отчетливо проявляется в том, что полумаксимальная константа ингибирования для обоих антител оказалась в области наномолярных концентраций (см. рис. 3 и 4).

Представленные в работе данные позволяют рекомендовать обе предложенные нами экспериментальные модели для скрининга и детального изучения новых веществ, способных блокировать взаимодействие PD-L1 с PD1. Более того, описанный в данной статье путь вполне осуществим с другими ингибиторными рецепторами клеток иммунной системы. Для этого необходимо создать генетически модифицированные линии клеток, устойчиво экспрессирующие рецептор, выбранный в качестве молекулярной мишени. В дополнение к таким клеткам необходимы также антитела и/или растворимая форма лиганда, способного связываться с рецептором, выбранным в качестве молекулярной мишени.

Выводы

1. Представлены две экспериментальные модели для скрининга и изучения блокаторов рецептора PD1 и лиганда PD-L1.

2. Специфичность модели доказана с помощью стандартных терапевтических антител пембролизумаб (анти-PD1) и атезолизумаб (анти-PD-L1)

3. Чувствительность модели по блокирующему действию указанных стандартных антител определена в области наномолярных концентраций блокатора.

4. В предложенной экспериментальной модели показана возможность изучения ингибирующего действия растворимых вариантов белков-лигандов и белков-рецепторов иммунных контрольных точек

Литература

1. Ishida Y., Agata Y., Shibahara K., Honjo T. Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. EMBO J. 1992; 11 (11): 3887-95. DOI: https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1992.tb05481.x

2. Blank C., Mackensen A. Contribution of the PD-L1/PD-1 pathway to T-cell exhaustion: an update on implications for chronic infections and tumor evasion. Cancer Immunol. Immunother. 2007; 56 (5): 739-45. DOI: https://doi.org/10.1007/s00262-006-0272-1

3. Chen R.Y., Zhu Y., Shen Y.Y., Xu Q.Y., Tang H.Y., Cui N.X., Jiang L., Dai X.M., Chen W.Q., Lin Q., Li X.Z. The role of PD-1 signaling in health and immune-related diseases. Front. Immunol. 2023;14: 1163633. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1163633

4. Dong H., Strome S.E., Salomao D.R., Tamura H., Hirano F., Flies D.B., Roche P.C., Lu J., Zhu G., Tamada K., Lennon V.A., Celis E., Chen L. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat. Med. 2002; 8 (8): 793-800. DOI: https://doi.org/10.1038/nm730

5. Butte M.J., Keir M.E., Phamduy T.B., Sharpe A.H., Freeman G.J. Programmed death-1 ligand 1 interacts specifically with the B7-1 costimulatory molecule to inhibit T cell responses. Immunity. 2007; 27 (1): 111-22. DOI: https://doi.org/10.1016/j.immuni.2007.05.016

6. Zou W., Wolchok J.D., Chen L. PD-L1 (B7-H1) and PD-1 pathway blockade for cancer therapy: Mechanisms, response biomarkers, and combinations. Sci. Transl. Med. 2016; 8: (328): 328rv4. DOI: https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aad7118

7. Topalian S.L., Taube J.M., Anders R.A., Pardoll D.M. Mechanism-driven biomarkers to guide immune checkpoint blockade in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 2016; 16 (5): 275-87. DOI: https://doi.org/10.1038/nrc.2016.36

8. Huang A.C., Postow M.A., Orlowski R.J., Mick R., Bengsch B., Manne S., Xu W., Harmon S., Giles J.R., Wenz B., Adamow M., Kuk D., Panageas K.S., Carrera C., Wong P., Quagliarello F., Wubbenhorst B., D’Andrea K., Pauken K.E., Herati R.S., Staupe R.P., Schenkel J.M., McGettigan S., Kothari S., George S.M., Vonderheide R.H., Amaravadi R.K., Karakousis G.C., Schuchter L.M., Xu X., Nathanson K.L., Wolchok J.D., Gangadhar T.C., Wherry E.J. T-cell invigoration to tumour burden ratio associated with anti-PD-1 response. Nature. 2017; 545 (7652): 60-5. DOI: https://doi.org/10.1038/nature22079

9. Sun Q., Hong Z., Zhang C., Wang L., Han Z., Ma D. Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends. Signal Transduct. Target Ther. 2023; 8 (1): 320. DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-023-01522-4

10. Kornepati A.V.R., Vadlamudi R.K., Curiel T.J. Programmed death ligand 1 signals in cancer cells. Nat. Rev. Cancer. 2022; 22 (3): 174-89. DOI: https://doi.org/10.1038/s41568-021-00431-4

11. Гринько Е.K., Донецкова А.Д. Основные подходы к применению моноклональных антител в иммунотерапии злокачественных новообразований. Иммунология. 2024; 45 (3): 355-366. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-3-355-366

12. Черткова А.И. Кадагидзе З.Г., Заботина Т.Н., Хуламханова М.М., Кушлинский Н.Е. CTLA-4, PD-1/PD-L1 негативные регуляторы Т-клеточного иммунитета в терапии рака яичников. Онкогинекология. 2019; 2: 4-15. eLIBRARY ID: 39113302.

13. Кадагидзе З.Г., Черткова А.И. Новые подходы к повышению эффективности противоопухолевого иммунного ответа. Иммунология. 2015; 36 (1): 66-70. DOI: https://doi.org/10.18027/2224-5057-2015-1-24-30

14. Кушлинский Н.Е., Фридман М.В., Морозов А.А., Черткова А.И., Герштейн Е.С., Кадагидзе З.Г. PD-1-путь: биологическая значимость, клиническое применение и существующие проблемы. Молекулярная медицина, 2019; (1): 40-2. DOI: https://doi.org/10.29296/24999490-2019-01-01

15. Wolchok J.D., Rollin L., Larkin J. Nivolumab and Ipilimumab in Advanced Melanoma. N. Engl. J. Med. 2017; 377 (25): 2503-04. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMc1714339

16. Wolchok J.D., Chiarion-Sileni V., Gonzalez R., Grob J.J., Rutkowski P., Lao C.D., Cowey C.L., Schadendorf D., Wagstaff J., Dummer R., Ferrucci P.F., Smylie M., Butler M.O., Hill A., Márquez-Rodas I., Haanen J.B.A.G., Guidoboni M., Maio M., Schöffski P., Carlino M.S., Lebbé C., McArthur G., Ascierto P.A., Daniels G.A., Long G.V., Bas T., Ritchings C., Larkin J., Hodi F.S. Long-Term Outcomes With Nivolumab Plus Ipilimumab or Nivolumab Alone Versus Ipilimumab in Patients With Advanced Melanoma. J. Clin. Oncol. 2022; 40 (2): 127-37. DOI: https://doi.org/10.1200/JCO.21.02229

17. Borgeaud M., Sandoval J., Obeid M., Banna G., Michielin O., Addeo A., Friedlaender A. Novel targets for immune-checkpoint inhibition in cancer. Cancer Treat. Rev. 2023; 120: 102614. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ctrv.2023.102614

18. Fukumoto Y., Obata Y., Ishibashi K., Tamura N., Kikuchi I., Aoyama K., Hattori Y., Tsuda K., Nakayama Y., Yamaguchi N. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 2010; 62 (1): 73-82. DOI: https://doi.org/10.1007/s10616-010-9259-z

19. Longo P.A., Kavran J.M., Kim M.S., Leahy D.J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enzymol. 2013; 529: 227-40. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-418687-3.00018-5

20. Krammer P.H., Arnold R., Lavrik I.N. Life and death in peripheral T cells. Nat. Rev. Immunol. 2007; 7 (7): 532-42. DOI: https://doi.org/10.1038/nri2115

21. D’Cruz L.M., Rubinstein M.P., Goldrath A.W. Surviving the crash: transitioning from effector to memory CD8+ T cell. Semin. Immunol. 2009; 21 (2): 92-8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.smim.2009.02.002

22. McKinstry K.K., Strutt T.M., Swain S.L. Regulation of CD4+ T-cell contraction during pathogen challenge. Immunol/ Rev. 2010; 236: 110-24. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1600-065X.2010.00921.x

23. Qin S., Xu L., Yi M., Yu S., Wu K., Luo S. Novel immune checkpoint targets: moving beyond PD-1 and CTLA-4. Mol. Cancer. 2019; 18 (1): 155. DOI: https://doi.org/10.1186/s12943-019-1091-2

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)