Рекомендации по созданию алгоритма валидации методик фенотипирования клеточных линий

• Покровский Никита Станиславович
• Водякова Марина Андреевна
• Меркулов Вадим Анатольевич
• Мельникова Екатерина Валерьевна

Резюме

Исследование посвящено сбору, анализу, объединению и интерпретации данных о подходах и дизайне валидации методик фенотипирования клеточных линий с использованием проточной цитометрии из работ различных групп авторов на протяжении двух десятилетий. На основании изученных научных данных в работе представлены результаты в виде алгоритма валидации методик фенотипирования клеточных линий, включающего шаги по описанию стратегии валидации и ее проведения, получению и анализу данных, а также по определению критериев приемлемости.

Ключевые слова: валидация; фенотипирование; проточная цитометрия; контроль качества; клеточные линии

Введение

Цели валидации методики - доказательство ее надежности, эффективности, создание возможности для ее аудита в случае разработки собственного внутрилабораторного метода анализа с использованием проточной цитометрии.

Валидация методик иммунофенотипирования жизнеспособных клеток человека, находящихся в составе препаратов [биомедицинские клеточные продукты (БМКП) и высокотехнологичные лекарственные препараты (ВТЛП)], имеет множество особенностей и отличий от традиционных методов лабораторного анализа [1, 2]. На сегодняшний день в мировой научной литературе до сих пор не достигнут консенсус по вопросу рекомендаций для валидации таких методик, а многие аспекты руководств Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute) еще практически не применяются [3, 4]. Немногочисленные работы на эту тему предлагают широко различающиеся подходы к решению этого вопроса [5].

Классическое и наиболее точное определение валидации аналитической методики - это подтверждение факта, что ряд определенных спецификаций методики являются подходящими и удовлетворительными для определенной цели применения путем исследования и предоставления объективных доказательств. Более простая интерпретация - характеристика производительности методики анализа с целью создания методологического каркаса для интерпретации данных. Точная и правильная интерпретация, как и трансфер метода между лабораториями, невозможны без детального понимания исследователем внутренних вариаций и ограничений метода [6].

Ранее авторами данного исследования были рассмотрены особенности валидации для методики фенотипирования клеточных линий методом проточной цитометрии, на основании нормативно-правовых документов и научной литературы выделены ключевые параметры валидации, которые включают правильность, прецизионность, специфичность, предел обнаружения, предел количественного определения, линейность, аналитическую область, а также чувствительность, граничное значение и фактор переноса [1, 7-10].

Основными источниками ошибочных данных в проточной цитофлуориметрии считаются такие параметры анализа, как качество образцов, схема и протокол проведения исследования, а также используемые методы настройки прибора, стандартизация, разделение положительных и отрицательных популяций, подсчет событий, анализ данных и их интерпретация [11].

Задача данной работы - отражение общих принципов и аспектов валидации методики иммунофенотипирования клеточных линий и предоставление обобщенных экспериментальных требований для валидации данной методики с учетом научных данных и руководств.

В научно-методической литературе нет общепринятого подхода к проведению валидации метода проточной цитометрии. Причины этого - большие различия в требованиях к образцам, результатам, их применению и подходам для каждого валидационного исследования, а также разные цели, которые ставят перед собой исследователи. Сложность метода проточной цитометрии в целом и иммунофенотипирования в частности также вносят весомый вклад в проблему крайне низкой степени стандартизации единых требований к этому методу по сравнению с другими методами лабораторного анализа [12]. Высокая вариабельность и сложность метода не позволяют унифицировать и гармонизировать рекомендации к нему, поэтому многие авторы предлагают более гибкий подход "fit-for-purpose", не давая четких рекомендаций по количеству образцов, повторов и разведений, необходимых для получения достоверных данных в ходе валидации. В табл. 1 представлены результаты анализа работ по валидации в рамках метода проточной цитометрии [3-6, 12-17]. Видно, что ни одна работа не предлагает четких рекомендаций по всем параметрам валидации для методики иммунофенотипирования, в то же время почти все авторы (70-80 %) дают значения для количества образцов и критериев приемлемости по параметру прецизионности, поскольку он наиболее показателен и важен в рамках валидации на проточном цитометре [1]. Кроме того, необходимо отметить, что в этой работе к рассмотрению добавлен параметр стабильность, представленный в большинстве проанализированных работ.

Также нужно обратить внимание на то, что, несмотря на детальное исследование по валидации метода проточной цитометрии, группа авторов из Международного совета по стандартизации в гематологии (ICSH - International Council for Standardization in Haematology) и Международного общества клинической цитометрии (ICCS - International Clinical Cytometry Society), выпустившая руководство из пяти частей [14, 15, 18-20], не предлагает простой схемы валидации, которую можно было бы быстро и легко применить в лаборатории. Для решения этой проблемы в настоящей работе мы предлагаем схему по проведению валидации методики иммунофенотипирования с использованием проточной цитометрии, основанную на сборе, анализе, объединении и интерпретации данных из работ различных групп авторов на протяжении двух десятилетий, которую можно широко применять для различных целей и задач каждого конкретного исследования. Таким образом, целью данной работы была разработка алгоритма валидации методики иммунофенотипирования по ключевым параметрам для подтверждения качества препаратов на основе жизнеспособных клеток человека.

Алгоритм валидации

Валидация метода является необходимым требованием после его разработки, однако применение руководств CLSI в лабораториях оказалось неоднозначным и трудоемким. Основная причина этого заключается в том, что многие аспекты валидации официально еще не установлены [4]. Валидационное исследование обычно состоит из четырех основных шагов (рис. 1). Следование им поможет эффективно спланировать и провести валидацию такой непростой методики, как иммунофенотипирование клеточных линий.

Пункты, представленные на рис. 1, следует выполнять последовательно: разработка стратегии валидации, протокола ее проведения и критериев приемлемости должна осуществляться заранее перед проведением испытаний.

Каждый этап должен сопровождаться соответствующим документом. Документирование этапа квалификации персонала и оборудования проводится в соответствии с установленными в проводящей валидационное исследование лаборатории или учреждении правилами. Разработка и описание стратегии валидации, составление ее протокола необходимо документально оформлять в виде плана валидации. Валидация проводится в соответствии со стандартной операционной процедурой (СОП) лаборатории, а результаты, обработка данных и выводы должны быть предоставлены в отчетном документе о проведенной валидации, где будет наглядно показано, валидирован ли данный метод. При планировании и составлении дизайна эксперимента необходимо учитывать и подробно документировать аспекты, которые при необходимости можно адаптировать под каждую конкретную методику. Информация, которая должна содержаться в документах, описывающих второй, третий и четвертый шаги валидации, подробно описана на рис. 2.

СОП по валидации следует писать таким образом, чтобы были соблюдены все регуляторные требования, при этом он должен быть понятным и удобным для использования исследователем. Информация, содержащаяся в СОП, может быть явно представлена в виде ссылки на другой СОП или на внутренний документ лаборатории. Отчет о валидации должен повторять структуру ее плана, содержать информацию и данные, полученные в ходе непосредственных экспериментов. Рассмотрение, утверждение и хранение данных, содержащихся в отчете о валидации, проводится в соответствии с порядками лаборатории.

Процесс валидации методики по своей природе итеративный, он не заканчивается после проведения. Необходимо отметить, что при появлении в лаборатории новой методики иммунофенотипирования или существенном изменении существующей требуется проводить ревалидацию [12]. Валидация и ревалидация требуют продолжительного и периодического повторного анализа данных и постоянной оптимизации анализируемого метода. Более детально каждый шаг рассматривается в следующих разделах [13].

Квалификация персонала и оборудования

Дизайн многопараметрического эксперимента на проточном цитофлуориметре - комплексная задача, требующая детального понимания принципов работы проточных цитофлуориметров, знания механизмов действия флуорохромов и концепции перекрытия их спектров, владения информацией о маркерах исследуемых клеточных линий, изучения внутриклеточных процессов, а также анализа полученных данных. Успех в разработке дизайна эксперимента валидации и ее применения на практике зависит от правильного определения инструментария, используемого при анализе, реагентов, процедур и типа образца.

Важным и основным требованием является постоянство полученных при помощи прибора результатов, которые необходимо подтверждать с помощью флуоресцентных калибровочных частиц каждый день перед проведением анализа. Кроме того, при разработке дизайна эксперимента валидации и ее непосредственном проведении важно принимать во внимание влияние субъективных решений оператора на результаты валидации. При каждом шаге, на котором оператор принимает какое-либо решение (проводит границу гейта или предпринимает другое действие, связанное с проведением анализа) исходя из своих субъективных предположений, есть вероятность получения немного отличающихся результатов двух анализов даже из одного набора исходных данных. Чаще всего такие различия не будут сказываться на результате анализа, однако в случаях, когда необходимо определить редкую популяцию в образце, субъективные действия разных операторов (или одного оператора в разное время) могут значительно исказить результат и даже изменить его. Для минимизации возможности появления субъективных факторов операторы анализа должны быть хорошо обучены, полностью понимать каждый шаг в ходе проведения валидации методики, быть способны точно и воспроизводимо его повторять. Дополнительно минимизировать фактор субъективного восприятия в ходе гейтирования и определения субпопуляций помогают шаблоны анализа и другие возможности автоматизации в современных версиях программного обеспечения, что позволяет надежно и однообразно анализировать схожие образцы, не полагаясь на человеческий фактор. Однако автоматический метод не всегда доступен, и в таких случаях по-прежнему применяется ручная установка гейтов [4].

Описание стратегии валидации и составление протокола

Подбор моноклональных антител

Для качественного проведения валидации методики иммунофенотипирования важно тщательно и обоснованно подобрать панель антител [6]. Выбор набора моноклональных антител, конъюгированных с флуорохромами, зависит от используемых клеточных линий: антитела должны взаимодействовать с определенными поверхностными маркерами, экспрессируемыми ей. Хорошо продуманные панели антител и протоколы исследований помогают в определении специфичности [16].

В проточной цитометрии тестовые наборы для диагностики in vitro (IVD), которые были составлены и утверждены производителем, доступны не для всех требований. Поэтому лаборатории обычно прибегают к модификации коммерчески доступных анализов или, чаще всего, к их разработке для удовлетворения собственных потребностей в рамках исследования.

Описание методов внедрения новых комбинаций антител в рутинную работу представлены в публикации [16] и не рассматриваются в данной работе.

Выбор количества экспериментальных точек

Следующим и основным этапом валидационного исследования является выбор количества экспериментальных точек. Этот шаг рекомендуется проводить заблаговременно, на этапе планирования и составления плана валидации, чтобы своевременно определить необходимые реагенты, контроли и тестовые образцы, их параметры и количество [13]. Также это поможет избежать ошибок, потери времени, лишнего расходования образцов и дорогостоящих реагентов. При применении подхода "fit-for-purpose" анализируемые валидационные параметры следует подбирать, основываясь на контексте использования данных, которые планируется получить в результате валидации [6]. В табл. 2 представлены рекомендуемые диапазоны для протокола валидации иммунофенотипирования в лабораториях уровня OMCL (Official Medicines Control Laboratories). Эти значения представляют собой обобщение доступных на данный момент научных рекомендаций; они помогают определиться с объемом исследования и оценить необходимое количество образцов, которое потребуется в процессе разработки валидации и ее дальнейшего проведения [3-6, 12-17].

Аналитический прогон определяется как набор шагов от пробоподготовки до ее анализа [6]. Этот параметр позволяет оценивать влияние вариабельности внешних условий, не связанных с образцом (например, различия между моделями приборов, операторами или лабораториями) на результаты анализа. В данном случае формулировка "3 аналитических прогона" может означать как проведение трех анализов в разные дни, так и проведение трех анализов в один день, но на трех разных приборах, и может выбираться на усмотрение исследователей. При этом, если внутрилабораторные испытания проводятся за один день, пробоподготовку и анализ для каждого прогона необходимо проводить по отдельности.

Так как значения, представленные в табл. 2, даны в виде диапазонов, при подборе окончательного количества экспериментальных точек рекомендуется исходить из объема доступного образца, строгости требований к исследуемой методике фенотипирования, количества приборов и персонала, а также срока годности образцов. Необходимо принимать во внимание тот факт, что большинство образцов ВТЛП/БМКП могут быть доступны в крайне малых объемах, из-за чего они не могут быть проанализированы в множестве повторений в рамках анализа повторяемости и воспроизводимости. Решения не проводить валидацию по какому-либо параметру либо использовать меньше повторов, чем рекомендуется, должны быть обоснованы. В реальных условиях работы лаборатории, когда доступные ресурсы (реагенты, объемы образца, количество оборудования и персонала) ограничены, бывает необходимо проводить валидацию с ограниченным числом испытаний [4]. Если можно использовать большее количество образцов, это повысит точность анализа, однако следует принимать во внимание экономическую и трудозатратную целесообразность такого решения. Для валидации методики фенотипирования также может использоваться суррогатный материал (клетки от здоровых доноров) в случае доказательства его репрезентативности клеточному материалу ВТЛП/БМКП.

Проведение валидации

Оно сводится к непосредственному проведению экспериментов по составленному плану. В данном разделе приведены аспекты практического применения параметров валидации, а также гейтирования, отмеченные при анализе научной литературы и руководств, в условиях проведения валидации методики иммунофенотипирования. Все определения и основные особенности представлены в предыдущей работе [1].

Специфичность

Специфичность в рамках метода проточной цитометрии и методики иммунофенотипирования по большей части рассматривается на этапе разработки дизайна валидации и его оптимизации. Протокол валидации должен содержать указания и информацию по составлению дизайна панели, от которой в значительной степени зависят специфичность и селективность анализа. В эту информацию могут входить рекомендации по выбору антигенов, подбору стратегии гейтирования или другие параметры, влияющие на специфичность [6].

Линейность

Так как для полуколичественного метода не проводят анализ на линейность, ее оценивают, рассчитывая коэффициент корреляции R² после линейной регрессии [4]. Такой подход требует анализа ряда образцов с последовательным разведением и построения графика зависимости ожидаемого значения количества событий (в искомом гейте, в целом образце или в интересующей популяции) от наблюдаемого значения, полученного в результате измерения [5].

Альтернативный путь анализа линейности заключается в использовании калибровочных флуоресцентных частиц, которые по своим спектральным и другим характеристикам должны быть схожи с объектами анализа. Использование набора частиц с диапазоном интенсивностей флуоресценции, покрывающим весь диапазон анализа, а также тщательное гейтирование синглетов, дублетов и триплетов способствует валидации по линейности путем демонстрации прямой зависимости между числом молекул эквивалентного растворимого флуорохрома (MESF - molecules of equivalent soluble fluorochrome) на частицах и средней интенсивности флуоресценции (MFI - mean fluorescent intensity) ряда популяций частиц. Эту зависимость определяют как для каждой модели прибора, используемой при проведении анализа, путем анализа калибровочных частиц в буферном растворе, так и для условий анализа - путем добавления раствора, содержащего частицы, в окрашенный образец, таким образом демонстрируя линейность измерения в реальных условиях проведения испытания. Линейность прибора демонстрируется и верифицируется каждые полгода в соответствии с СОП лаборатории. Такая частота проверки линейности считается достаточной и подходящей для анализа линейности количественных методик [15].

Прецизионность

Прецизионность (и входящие в нее повторяемость, внутрилабораторная прецизионность и воспроизводимость) является наиболее важным параметром валидации методики иммунофенотипирования. Как только в процессе валидации установлена прецизионность среди параллельных определений, исследователь может сделать вывод о том, что данные, превышающие погрешность таких определений, являются значимыми и не являются системным шумом. Эта информация также полезна при трансфере методики между лабораториями, приборами либо аналитиками, так как она представляет собой объект сравнения результатов анализа между лабораториями [6].

Стратегия факторного дизайна валидации, при которой несколько факторов измеряются в ходе одного эксперимента [21] (в отличие от дизайна, когда каждый фактор определяется в отдельном эксперименте), рекомендуется к использованию при определении внутрилабораторной прецизионности, так как ее применение позволяет повысить эффективность валидации иммунофенотипирования и сократить затрачиваемое на нее время. Недостатком такого подхода является то, что он не позволяет в ходе измерения внутрилабораторной вариабельности отличить влияние прибора от влияния оператора. Необязательно, чтобы каждый измеряемый образец проходил по критерию вариабельности, если обобщенный коэффициент вариации (CV) лежит в требуемом диапазоне. Тем не менее, если какой-то показатель одного из образцов выходит за допустимые границы, это следует указать и объяснить в отчете о валидации [6].

Правильность

Определение параметра правильности необходимо для клинических анализов, однако стандартов для ее определения не существует, в связи с чем применяется альтернативный подход, требующий сравнения результатов измерений правильности двух разных лабораторий [6]. Этот подход довольно трудно осуществим, так как не во всех лабораториях есть возможности и ресурсы для такой кооперации в рамках проведения валидации одной методики. Даже если нет возможности установить абсолютную правильность (близость измеряемого значения к истинному или референсному значению) для некоего биомаркера, относительная правильность (также известная, как trueness - близость между средним значением ряда измерений и референсным значением) также может быть очень полезным и информативным параметром [13].

Чувствительность и пределы обнаружения

Чувствительность анализа важна в тех случаях, когда необходимо изучить редкие или слабофлуоресцирующие популяции [6]. Ее можно исследовать оценкой ключевых параметров, включая LOB, LOD и LLOQ.

Предел холостой пробы (LOB) - это самый высокий сигнал, полученный в отсутствие искомого вещества в пробе. Сигнал 95 % всех отрицательных проб должен лежать ниже этой границы.

Предел обнаружения (LOD) по смыслу близок к пределу холостой пробы (LOB): на этом уровне обычно определяются тусклые образцы с низким сигналом. Сигнал 95 % всех тусклых образцов должен находиться выше уровня LOB.

LLOQ - это наименьший из сигналов образцов, который можно определить с высокой надежностью (LOD). При определенных обстоятельствах LLOQ может находиться на одном уровне с LOD, но никогда ниже. Определение LLOQ - это критический шаг при анализе с использованием высокочувствительной проточной цитометрии, которое с высокой правильностью и повторяемостью можно осуществить, подобрав подходящие для этого образцы с низким уровнем сигнала. LOB и LOD можно валидировать на основе результатов, полученных анализом изотипического контроля. Потенциально низкая надежность и повторяемость результатов, получаемых в реальных лабораториях в ходе определения редких и тусклых популяций, могут быть решены проведением систематической валидации [4, 15].

Более подробные рекомендации по определению чувствительности представлены в указанных выше работах, а также в работе D.M. O’Hara и соавт. [3]. Уравнения для расчета этих параметров представлены в разделе по анализу данных.

Граничное значение (cut-off)

Из систематизированных данных в табл. 1 видно, что ни одна из исследованных работ не приводит рекомендаций по числу требуемого количества измерений для граничного значения и его критериев приемлемости.

В случае иммунофенотипирования метод определения параметра cut-off совпадает с проведением стратегии гейтирования. Например, при определении доли субпопуляции нейтрофилов в образце крови гейтирование по FSC и SSC, по сути, является установлением значений cut-off для интересующей популяции. Валидацию этого параметра можно провести путем иммунофенотипирования охарактеризованного образца клеток и сравнением долей искомых популяций при установленных гейтах с их истинным значением. В случае несовпадения можно провести повторное гейтирование в ручном или автоматическом режиме.

Фактор переноса (carryover)

Валидация фактора переноса между образцами при использовании цитометра с автоматизированной подачей образцов является важным аспектом флуоресцентных клеточных анализов, в частности при проведении анализа редких событий.

Однако для проточной цитометрии источник переноса образца от пробирки к пробирке часто является аппаратной проблемой, особенно при использовании приборов с карусельным или многолуночным дизайном. Поэтому фактор переноса можно определить схожим с определением линейности способом - при помощи использования частиц или клеток с различными уровнями интенсивности флуоресценции. Для этого пробирки с образцами с высоким и низким уровнями интенсивности флуоресценции расставляют поочередно на планшете и анализируют в соответствии со схемой в выбранном количестве повторений (рис. 3).

Поскольку коммерческие частицы имеют характерное светорассеяние и постоянную интенсивность флуоресценции, с их помощью можно определить уровень влияния фактора переноса с точностью < 1 % [15].

Стабильность

Стабильность образца должна определяться для каждого используемого антикоагулянта и прочих факторов стабильности. Стабильность образцов для оценки эффекта от смешивания образцов со стабилизатором на протяжении определенного времени рекомендуется определять на двух группах образцов: с добавлением стабилизатора и без него. Далее проводится оценка стабильности на 4 временных точках, помимо изначальной (0, 4, 24, 28, и 48 ч) [4]. Если это возможно, время, требуемое для полного цикла измерения образца первой контрольной точки (0 ч), содержащего жизнеспособные клетки человека, не должно превышать 2 ч, хотя на практике такое трудноосуществимо, особенно если образцы поступают от производителя. В подобных случаях такой образец нужно проанализировать как можно быстрее. Проведение анализа на стабильность следует проводить в тех же условиях, что и анализ образцов, которые будут измеряться в ходе рутинного применения этой методики [6]. В первую очередь эти условия включают температуру в помещении, температуру хранения, а также влажность, циклы и условия заморозки-разморозки и др. Влияние показателя жизнеспособности на проведение анализа необходимо проанализировать. Если дизайн валидации подразумевает это, стабильность следует оценивать на всех субпопуляциях образца. Например, изолированные и криоконсервированные клетки следует регулярно анализировать на стабильность после цикла заморозки-разморозки. Стабильность определяется в последней временной точке анализа, в которой было зафиксировано 20-процентное изменение по сравнению с изначальным уровнем либо в которой как минимум 80 % образцов имеют жизнеспособность в пределах погрешности анализа [4, 15].

Если хранение образов во время проведения эксперимента по стабильности происходит в охлажденном или замороженном состоянии, при измерении образца очередной контрольной точки остальные образцы рекомендуется не доставать, а держать при постоянной температуре. Это позволит получить наиболее точные и приближенные к реальности данные о стабильности ВТЛП/БМКП.

Гейтирование

Преимущества технологии проточной цитофлуориметрии состоят не только в ее способности к одновременному многопараметрическому анализу, но и в гибкости возможностей представления отчетов об испытании различными способами. Способ предоставления результатов, полученных этим методом, может зависеть от нескольких факторов: от биологических особенностей исследуемого образца, научной или аналитической задачи, решаемой данным исследованием, и от области применения полученных результатов.

Установление границы между двумя четко определенными популяциями клеток с достаточно хорошо различимыми клеточными маркерами в большинстве случаев не вызывает трудностей. Однако если популяции клеток в образце недостаточно хорошо разделяются, выбор стратегии гейтирования усложняется, а вероятность различий вследствие субъективного восприятия операторов резко увеличивается, что может привести к низкой повторяемости и прецизионности в ходе валидации. Установление и стандартизация стратегии гейтирования с четкой границей разделения популяций с высоким постоянством поможет минимизировать разброс данных и повысит эффективность валидации метода проточной цитометрии.

Необходимо отметить, что в ходе гейтирования любые ошибки имеют свойство накапливаться с каждым последующим зависимым гейтом [14]. Поэтому стратегию гейтирования следует периодически сверять с установленной и корректировать при несоответствии установленным в протоколе параметрам.

Получение и анализ данных

Математическая оценка проводится для проверки достоверности результатов исследования и доказательства наличия или отсутствия статистических различий в результатах подсчетов клеток различными методами, приборами, аналитиками, а также различия в результатах, полученных в разные дни или при различных условиях. За прошедшие годы предпринимался ряд попыток к улучшению качества статистических подходов в разработке и анализе экспериментов по валидации метода проточной цитофлуориметрии [16].

Расчет CV индивидуального образца, применяемого для оценки многих параметров валидации, проводят из стандартного отклонения (SD) ряда повторений и его среднего значения по формуле:

Для представления значения общей повторяемости между всеми образцами в анализе можно использовать интервал всех полученных значений:

Результаты испытания на линейность представляются в виде графика линейной зависимости фактических концентрации и жизнеспособности от ожидаемых, а также уравнения линейной регрессии. Коэффициенты R² и CV для каждой экспериментальной точки также оцениваются в соответствии с критериями приемлемости. Коэффициент R² в большинстве программ по статистической обработке можно рассчитать автоматически. На графике рекомендуется отметить точку пересечения с осью ординат, тангенс угла наклона прямой и остаточную сумму квадратов отклонений.

Предел обнаружения холостой пробы рассчитывается из среднего значения в исследуемом гейте, полученного на всех образцах, и стандартного отклонения. Затем таким же образом вычисляется предел обнаружения. Уравнения для расчетов пределов детекции представлены ниже:

Для оценки стабильности препаратов и образцов необходимо показать, как изменились показания образца в данной временнóй точке. Для этого можно воспользоваться следующей расчетной формулой:

где T₀ - начальная временная точка (0 ч), T_i - текущая анализируемая временная точка.

Фактор переноса рассчитывается при помощи уравнения:

Решение о том, следует ли включать выбросы (значения, лежащие очень далеко от общей группы значений и существенно смещающие среднее или медиану) в данные для математической обработки, может повлиять на результат валидации, однако не является статистической задачей. Правила, по которым следует обращаться с точками выбросов, должны определяться заранее на стадии дизайна эксперимента [6]. Наиболее простой способ учета выбросов - это проведение измерений в двух повторениях в случайном порядке [16].

Анализ данных, как правило, является завершающим шагом в процессе выполнения методики, тем не менее ошибки, появившиеся на одном из ранних этапов анализа, в значительной степени могут снизить эффективность стратегии интерпретации полученных данных. Для того чтобы избежать или, по крайней мере, минимизировать такой исход, в ходе разработки методики проведения анализа данных крайне важно удостовериться, что такая методика обладает достаточной устойчивостью к внесенным ошибкам и что используемые в ходе ее проведения инструменты правильно настроены, а стратегия и дизайн аналитической методики тщательно продуманы. Наиболее часто представляемыми показателями в результате проведения цитофлуориметрического анализа являются показатели жизнеспособности образца, количества клеток на единицу объема, абсолютное количество клеток и доли определенной популяции клеток в пробе [15], однако в определенных случаях они могут быть представлены как количество молекул на клетку либо в каких-то других единицах, имеющих наиболее удобный вид для данного анализа. В случаях, когда в анализе при выборе параметров или при настройке гейтирования присутствует фактор субъективности оператора, важно заранее определить степень воспроизводимости в настройке таких параметров между несколькими операторами либо одного оператора в разные промежутки времени.

При представлении данных, полученных в ходе цитометрического анализа, рекомендуется включать графическое отображение полученных результатов. Контурные графики, гистограммы, точечные диаграммы (dot plot) могут более наглядно донести информацию об анализируемом образце. Линейные преобразования чаще всего используются для отображения параметров светового рассеяния. Логарифмические преобразования обычно используются для параметров, имеющих широкий диапазон значений интенсивности (обычно несколько порядков). Ширина бина гистограммы обратно пропорциональна интенсивности, что позволяет популяциям клеток с различной интенсивностью свечения визуально разделяться на одном графике. Сигнал, полученный на приборе, может представляться как в виде MFI или медианной интенсивности флуоресценции (MdFI - median fluorescent intensity), так и GMFI (средней геометрической интенсивности флуоресценции). MdFI показывает такое значение интенсивности в популяции, что ровно половина событий в образце имеют интенсивность меньше MdFI, а вторая половина - больше. MFI показывает среднее арифметическое значение интенсивности событий внутри гейта. Результат измерения интенсивности рекомендуется представлять в виде MFI/MdFI гейтированной популяции. Для большинства случаев в цитофлуориметрических анализах медианное значение предпочтительнее среднего, так как оно менее подвержено влиянию выбросов [6].

Критерии приемлемости

На завершающем этапе проведения валидации необходимо определить и установить критерии приемлемости (желательно сделать это заранее - перед проведением эксперимента) и внести их в план валидации. На установление критериев приемлемости главным образом влияют 3 фактора: во-первых, критерии должны соответствовать заранее определенным целям валидации, а не просто отражать технические возможности самой методики; во-вторых, важным фактором является характер методологии и данные, генерируемые в ходе проведения этого анализа; в-третьих, биологически обусловленная вариабельность в результате анализа биомаркеров как внутри, так и между популяциями [13].

Для оценки параметров валидации методики фенотипирования клеток в табл. 3 представлены критерии приемлемости [3-6, 12-17].

Критерии приемлемости позволяют аналитику сравнивать показатели производительности разных версий методики, а также утверждать, являются ли характеристики методики адекватными и подходящими для ее предполагаемого использования [16]. В некоторых случаях такая оценка методики может продемонстрировать необходимость дальнейшего исследования или сигнализировать о каких-то ограничениях этой методики, которые полезно учитывать в дальнейшем при ее применении, что стимулирует ее дальнейшую итеративную оптимизацию, усовершенствование и улучшение.

Если полученные данные не соответствуют критериям анализа, следует рассмотреть ряд вероятных причин [6]. В частности, такими причинами могут быть целевой результат, находящийся вне диапазона выбранных критериев, либо большой разброс значения результата, который не позволяет сделать вывод о его достоверности. Наконец в эксперименте могут отсутствовать репрезентативные образцы (например, положительный контроль). В первом случае необходимо модифицировать сам метод, в остальных случаях может понадобиться проведение дополнительных исследований [16]. Если в результате расследования несоответствия критериям приемлемости обнаруживается, что ни прибор, ни операторы не являются его причиной, последнюю следует искать в неоптимальном дизайне протокола валидации [6].

Методику считают валидированной при условии, что все тестируемые параметры соответствуют критериям приемлемости. Отклонение по одному или нескольким параметрам должно быть обосновано.

Заключение

Проведение цитометрических анализов, в частности методики иммунофенотипирования клеточных линий, для производства или контроля качества ВТЛП/БМКП, подразумевает контроль таких методов регуляторным органом и соответствие предъявляемым требованиям. Для доказательства данного соответствия такая методика должна быть валидирована, а результаты валидации подробно описаны и задокументированы.

В данном исследовании были описаны шаги валидационного исследования: квалификация персонала и оборудования; описание стратегии валидации и утверждение протокола; непосредственная валидация, а также сбор данных и составление отчетов о валидации. Отмечена важность калибровки прибора для подтверждения постоянства получаемых результатов и учета влияния субъективных решений оператора на результаты валидации. В рамках описания стратегии валидации и составления протокола описан выбор количества экспериментальных точек, для которого впервые обобщены все доступные научные рекомендации по валидационным параметрам. Для непосредственного проведения валидации приведены важные аспекты практического применения параметров валидации. Описаны математическая оценка и анализ полученных данных, впервые обобщены критерии приемлемости для всех параметров.

Литература

1. Покровский Н.С., Водякова М.А., Меркулов В.А., Мельникова Е.В. Особенности и ключевые параметры валидации методик фенотипирования клеточных линий, входящих в состав препаратов клеточной терапии. Иммунология. 2024; 45 (3): 343-54. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-3-353-354

2. Трусов Г.А., Чапленко А.А., Семенова И.С., Мельникова Е.В., Олефир Ю.В. Применение проточной цитометрии для оценки качества биомедицинских клеточных продуктов. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2018; 18 (1): 16-24. DOI: https://doi.org/10.30895/2221-996X-2018-18-1-16-24

3. O’Hara D.M., Xu Y., Liang Z., Reddy M.P., Wu D.Y., Litwin V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 2011; 363 (2): 120-34. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jim.2010.09.036

4. Kim H., Shin S., Hwang S.H., Kim M., Cho Young-uk, Jang S. Validation of High-sensitivity Flow Cytometry for Reliable Immune Cell Analysis in Real-world Laboratory Settings. Ann. Lab. Med. 2023; 43 (6): 620-4. DOI: https://doi.org/10.3343/alm.2023.43.6.620

5. Viganò M., Budelli S., Lavazza C., Montemurro T., Montelatici E., De Cesare S., Lazzari L., Orlandi A.R., Lunghi G., Giordano R. Tips and Tricks for Validation of Quality Control Analytical Methods in Good Manufacturing Practice Mesenchymal Stromal Cell Production. Stem Cells Int. 2018; 2018: 1-16. DOI: https://doi.org/10.1155/2018/3038565

6. Selliah N., Nash V., Eck S., Green C., Oldaker T., Stewart J., Vitaliti A., Litwin V. Flow Cytometry Method Validation Protocols. Curr. Protoc. Cytom. 2023; 3 (8): e868. DOI: https://doi.org/10.1002/cpz1.868

7. European Medicines Agency (EMA). ICH Q14 Guideline on analytical procedure development. 2023. URL: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/ich-q14-guideline-analytical-procedure-development-step-5_en.pdf

8. European Medicines Agency (EMA). ICH Topic Q2 (R2) Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology. 2023. URL: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/ich-q2r2-guideline-validation-analytical-procedures-step-5-revision-1_en.pdf

9. CLSI. H62. Validation of Assays Performed by Flow Cytometry. 1^st ed. 2021. 234 p. ISBN: 978-1-68440-128-4

10. Министерство здравоохранения Российской Федерации. Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания. ОФС.1.1.0012 "Валидация аналитических методик". 2023. URL: https://pharmacopoeia.regmed.ru/pharmacopoeia/izdanie-15/1/1-1/validatsiya-analiticheskikh-metodik/

11. Burel J.G., Qian Y., Lindestam Arlehamn C., Weiskopf D., Zapardiel-Gonzalo J., Taplitz R., Gilman R.H., Saito M., De Silva A.D., Vijayanand P., Scheuermann R.H., Sette A., Peters B. An Integrated Workflow To Assess Technical and Biological Variability of Cell Population Frequencies in Human Peripheral Blood by Flow Cytometry. J. Immunol. 2017; 198 (4): 1748-58. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1601750

12. Dorn-Beineke A., Sack U. Quality control and validation in flow cytometry. Laboratoriums Medizin. 2016; 40 (s1): 000010151520160016. DOI: https://doi.org/10.1515/labmed-2016-0016

13. Lee J.W., Devanarayan V., Barrett Y.C., Weiner R., Allinson J., Fountain S., Keller S., Weinryb I., Green M., Duan L., Rogers J.A., Millham R., O’Brien P.J., Sailstad J., Khan M., Ray C., Wagner J.A. Fit-for-Purpose Method Development and Validation for Successful Biomarker Measurement. Pharm Res. 2006; 23 (2): 312-28. DOI: https://doi.org/10.1007/s11095-005-9045-3

14. Tangri S., Vall H., Kaplan D., Hoffman B., Purvis N., Porwit A., Hunsberger B., Shankey T.V. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS - part III - analytical issues. Cytometry B. Clin. Cytom. 2013; 84 (5): 291-308. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.b.21106

15. Wood B., Jevremovic D., Béné M.C., Yan M., Jacobs P., Litwin V. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS - part V - assay performance criteria. Cytometry B. Clin. Cytom. 2013; 84 (5): 315-23. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.b.21108

16. Lambert C., Yanikkaya D. G., Keller T., Preijers F., Psarra K., Schiemann M., Özçürümez M., Sack U. Flow Cytometric Analyses of Lymphocyte Markers in Immune Oncology: A Comprehensive Guidance for Validation Practice According to Laws and Standards. Front. Immunol. 2020; 11: 2169. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.02169

17. Mfarrej B., Gaude J., Couquiaud J., Calmels B., Chabannon C., Lemarie C. Validation of a flow cytometry-based method to quantify viable lymphocyte subtypes in fresh and cryopreserved hematopoietic cellular products. Cytotherapy. 2021; 23 (1): 77-87. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jcyt.2020.06.005

18. Davis B.H., Wood B., Oldaker T., Barnett D. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS - part I - rationale and aims. Cytometry B. Clin. Cytom. 2013; 84 (5): 282-5. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.b.21104

19. Davis B.H., Dasgupta A., Kussick S., Han J.Y., Estrellado A. Validation of cell-based fluorescence assays: practice guidelines from the ICSH and ICCS - part II - preanalytical issues. Cytometry B. Clin. Cytom. 2013; 84 (5): 286-90. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.b.21105

20. Barnett D., Louzao R., Gambell P., De J., Oldaker T., Hanson C.A. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS - part IV - postanalytic considerations. Cytometry B. Clin. Cytom. 2013; 84 (5): 309-14. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.b.21107

21. Collins L.M., Dziak J.J., Li R. Design of experiments with multiple independent variables: A resource management perspective on complete and reduced factorial designs. Psychol Methods. 2009; 14 (3): 202-24. DOI: https://doi.org/10.1037/a0015826

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)