Влияние интерлейкина-37 на процесс НЕТоза у нейтрофилов человека in vitro

• Никольский Александр Аркадьевич
• Шиловский Игорь Петрович
• Воробьева Нина Викторовна
• Юмашев Кирилл Валерьевич
• Пасихов Георгий Борисович
• Ковчина Валерия Ивановна
• Тимотиевич Екатерина Драгановна
• Русак Татьяна Евгеньевна
• Каганова Мария Михайловна
• Тюлюбаев Вадлен Вадимович
• Брылина Вера Евгеньевна
• Гудима Георгий Олегович
• Кудлай Дмитрий Анатольевич
• Хаитов Муса Рахимович

Резюме

Введение. Нейтрофильные внеклеточные ловушки (NETs) играют важную роль в иммунном ответе организма, способствуя нейтрализации патогенов. Однако избыточное образование NETs может приводить к развитию воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Интерлейкин-37 (ИЛ-37) - противовоспалительный цитокин, способный ингибировать воспалительные реакции, в том числе - опосредованные нейтрофилами. Однако сведения о влиянии ИЛ-37 на процесс НЕТоза противоречивы.

Цель настоящего исследования - изучить влияние ИЛ-37 на процесс НЕТоза в нейтрофилах человека in vitro.

Материал и методы. Нейтрофилы, выделенные из крови здоровых доноров, стимулировали форбол-12-миристат-13-ацетатом (ФМА) для индукции НЕТоза. Коммерческий ИЛ-37 добавляли в культуральную среду в различных концентрациях (0,5; 2,5; 10 и 100 нг/мл) и оценивали его влияние на процесс НЕТоза. Визуализацию NETs проводили с использованием флуоресцентного окрашивания и имиджинговой системы Celena X.

Результаты. В нейтрофилах, активированных ФМА, но не обработанных ИЛ-37, процент НЕТоза составлял 92 %. Предварительная инкубация нейтрофилов с ИЛ-37 в различных концентрациях не приводила к снижению доли нейтрофилов, образующих NETs, по сравнению с клетками, стимулированными только ФМА.

Заключение. Полученные результаты не подтверждают предположение о том, что ИЛ-37 способен подавлять НЕТоз путем прямого воздействия на нейтрофилы.

Ключевые слова: нейтрофильные внеклеточные ловушки; интерлейкин-37; НЕТоз

Введение

Нейтрофильные внеклеточные ловушки (neutrophil extracellular traps - NETs) представляют собой внеклеточные сетчатые структуры, состоящие из нитей ДНК, гистонов и антимикробных белков, таких как миелопероксидаза и эластаза нейтрофилов. Эти ловушки выделяются активированными нейтрофилами в ответ на патогены (бактерии, вирусы, грибы и простейшие) и играют важную роль во врожденном иммунном ответе, способствуя захвату и нейтрализации микроорганизмов. NETs были впервые описаны в 2004 г. и с тех пор изучаются как ключевой компонент нейтрофильного ответа на патогены [1-3].

Помимо их роли в защите организма, накоплено множество данных, свидетельствующих о том, что NETs участвуют в патогенезе различных воспалительных и аутоиммунных заболеваний, в частности системной красной волчанки, ревматоидного артрита и псориаза. Кроме того, они могут усиливать воспалительные процессы, способствуя активации инфламмасом и взаимодействуя с молекулярными фрагментами, ассоциированными с повреждениями, приводя к активации иммунных клеток и усугубляя воспалительные реакции [4]. Все это делает NETs важным элементом не только защиты организма от патогенов, но и участником патогенеза хронических воспалительных заболеваний.

Кроме того, NETs играют важную роль в развитии тромбоза. Исследования показывают, что некоторые компоненты NETs, такие как гистоны и антимикробные белки, могут вызывать активацию тромбоцитов и способствовать образованию тромбов. Это особенно важно в контексте воспалительных заболеваний, таких как атеросклероз и васкулиты, где NETs могут усиливать повреждение сосудов и способствовать образованию тромбов [1].

Интерлейкин-37 (ИЛ-37), цитокин из семейства ИЛ-1, представляет собой важный медиатор противовоспалительных реакций. ИЛ-37 был открыт относительно недавно и в настоящее время его значение в регуляции воспалительного ответа активно изучается. Известно, что ИЛ-37 подавляет продукцию провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНОα, а также участвует в подавлении врожденного иммунитета через регуляцию ключевых сигнальных путей, таких как путь NF-κB [5].

Недавние исследования показали, что ИЛ-37 может влиять на процесс образования NETs нейтрофилами - НЕТоз, который представляет специфическую форму клеточной гибели нейтрофилов, отличающуюся от апоптоза и некроза, сопровождающуюся выбросом медиаторов и формированием характерных нитей ДНК (NETs). НЕТоз часто возникает в ответ на активацию нейтрофилов различными стимулами, такими как патогены или воспалительные факторы [6, 7].

В свете этих данных становится очевидно, что чрезмерное или неконтролируемое образование NETs оказывает неблагоприятный эффект, способствуя развитию воспалительных и аутоиммунных заболеваний, а также тромбозов. Следовательно, поиск методов регулирования НЕТоза является важной задачей современной медицины. Благодаря своим известным противовоспалительным свойствам [8], ИЛ-37 является негативным регулятором НЕТоза. К тому же многими исследователями доказана способность ИЛ-37 снижать воспаление, в том числе опосредованное нейтрофилами [5, 9, 10]. Однако данные о возможности прямого влияния этого цитокина на нейтрофилы и процесс образования ими NETs остаются противоречивыми. Поэтому цель данного исследования - изучить эффекты ИЛ-37 на процесс НЕТоза in vitro.

Материал и методы

Участники исследования и забор образцов. Для исследования использовали образцы венозной крови, полученные от здоровых доноров в возрасте от 18 до 50 лет, не имеющих воспалительных заболеваний или инфекций в течение последних 3 мес. Образцы крови собирали в пробирки с гепарином для предотвращения коагуляции. Общий объем забранной крови составил около 10 мл на участника исследования. Исследование было одобрено этическим комитетом и все доноры крови подписали информированное согласие на участие.

Выделение нейтрофилов. Для выделения нейтрофилов из цельной крови использовали центрифугирование в градиенте плотности с использованием раствора фиколла 1,077 г/см³ ("ПанЭко", Россия). Процесс выделения включал следующие этапы: кровь разбавляли средой 199 с солями Хенкса и глутамином ("ПанЭко", Россия) в соотношении 1 : 1; полученный раствор осторожно наслаивали на фиколл и центрифугировали при 800 g в течение 60 мин при комнатной температуре без торможения. После центрифугирования забирали слой нейтрофилов, находящийся между слоем эритроцитов и раствором фиколла; затем использовали 0,2 и 1,6 % NaCl ("ХлоренХима", Россия) для лизиса эритроцитов, которые могли оказаться вместе с нейтрофилами; после этого ресуспендировали клеточный осадок в полной питательной среде RPMI-1640 с глутамином ("ПанЭко", Россия) с добавлением 1 % эмбриональной телячьей сыворотки (Biosera, Южная Америка) для дальнейшего использования. Чистоту выделения нейтрофилов оценивали с помощью красителя Задорожного-Дозморова [Азур II ("ПанЭко", Россия) + Triton X-100 (BioFroxx, Германия)], она составляла не менее 98 %. Жизнеспособность клеток, которую определяли по исключению 0,1 трипанового синего, составляла более 99 %.

Индукция НЕТоза. Для активации НЕТоза использовали форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) (Sigma-Aldrich, США) - мощный индуктор активации протеинкиназы C, который стимулирует образование NETs. Нейтрофилы засевали на 24-луночные планшеты (TPP, Швейцария) в количестве 50 000 клеток на лунку и инкубировали 20 мин при +5 °C. Затем вносили коммерческий ИЛ-37 (Cloud-Clone Corp., Китай) в различных концентрациях (0,5; 2,5; 10; 100 нг/мл). Проводили инкубацию при 37 °C в условиях 5 % CO₂ в течение 1 ч. Затем клетки стимулировали ФМА в конечной концентрации 100 нМ и инкубировали при 37 °C в условиях 5 % CO₂ в течение 3,5 ч. Несколько лунок оставляли в качестве контролей: положительного (только с ФМА и без коммерческого ИЛ-37) и отрицательного (без внесения ФМА).

Визуализация NETs. Для оценки NETs использовали флуоресцентное окрашивание. Для этого в среду инкубации вносили флуоресцентный краситель нуклеиновых кислот LUCS 13 (Lumiprobe, Россия) в конечной концентрации 1 мкМ. Флуоресцентные изображения получали с использованием имиджинговой системы Celena X (Logos Biosystems, Южная Корея), при этом NETs визуализировались как волокнистые структуры нуклеиновых кислот (λ возбуждения/испускания - 488/514 нм).

Количественный анализ NETs. Оценивали количество клеток, демонстрирующих образование NETs. Изображения анализировали в разных полях зрения, и процент клеток, формирующих NETs, определяли относительно общего числа клеток. Подсчитывали не менее 100 клеток в каждом образце, используя несколько независимых полей зрения.

Статистический анализ. Для всех количественных данных вычисляли медиану и межквартильный размах. Определяли межгрупповые различия с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса с использованием программы Statistica 12.0 (StatSoft inc., США).

Результаты

Влияние ИЛ-37 на образование NETs нейтрофилами человека in vitro представлено на рис. 1А. После выделения нейтрофилов они были проинкубированы с различными концентрациями ИЛ-37 (0; 0,5; 2,5; 10 и 100 нг/мл) в течение 1 ч, после чего осуществляли индукцию НЕТоза при помощи ФМА, как описано выше.

В отсутствии ИЛ-37 доля нейтрофилов, образующих NETs, составила 92 [92; 93] % (Ме [Q1; Q3]). При добавлении коммерческого ИЛ-37 в различных концентрациях (0,5; 2,5; 10 и 100 нг/мл) не происходило статистически значимого снижения доли клеток, осуществляющих НЕТоз. При концентрации 0,5 нг/мл ИЛ-37 доля клеток, осуществляющих НЕТоз, составила 89 [89; 92] % (Ме [Q1; Q3]), при 2,5 нг/мл - 92 [92; 93] % (Ме [Q1; Q3]), при 10 нг/мл - 91 [87; 92] % (Ме [Q1; Q3]), а при 100 нг/мл - 91 [90; 92] % (Ме [Q1; Q3]). Статистический анализ с использованием критерия Краскелла-Уоллиса не выявил значимых различий между клетками, стимулированными только ФМА, и клетками, инкубированными с ИЛ-37 в различных концентрациях.

На рис. 1Б представлены микрофотографии нейтрофилов человека, окрашенных флуоресцентным красителем после инкубации с различными концентрациями ИЛ-37 и стимуляции ФМА для индукции НЕТоза. В положительном контроле, где нейтрофилы стимулировались только ФМА без добавления ИЛ-37, отмечено выраженное образование NETs, характеризующееся наличием зеленых волокнистых структур. В противоположность этому, в отрицательном контроле, где нейтрофилы не подвергались стимуляции ФМА и обработке ИЛ-37, клетки оставались интактными и не проявляли признаков НЕТоза. В клетках, инкубированных с ИЛ-37, не наблюдалось предотвращение образования NETs, что визуально было сопоставимо с положительным контролем.

Обсуждение

Полученные результаты демонстрируют, что ИЛ-37 не оказывает прямого влияния на образование NETs. В ранее опубликованном исследовании B. Li и соавт. продемонстрировано, что ИЛ-37 в концентрации 0,1 нг/мл при инкубации с нейтрофилами человека уменьшал их способность образовывать NETs примерно на 30 % [9].

В проведенном нами исследовании ИЛ-37 в широком диапазоне концентраций (от 0,5 до 100 нг/мл) инкубировали с нейтрофилами в течение 4,5 ч. При этом мы не выявили никакого эффекта на процесс НЕТоза. Такие отличия в результатах, полученными нами и B. Li и соавт., можно объяснить различиями в методических подходах.

В проведенном исследовании мы проводили подсчет адгезированных в лунках планшета клеток, осуществляющих НЕТоз, методом флуоресцентной микроскопии, в то время как B. Li и соавт. измеряли концентрацию двуспиральной ДНК (дсДНК) в супернатантах. При этом концентрация дсДНК в супернатантах и количество зафиксированных на пластике окрашенных ДНК-нитей может не совпадать. Также стоит отметить, что в нашем исследовании мы изучили широкий диапазон концентраций ИЛ-37 (от 0,5 до 100 нг/мл), в то время как в работе B. Li и соавт. была использована лишь одна концентрация ИЛ-37 (0,1 нг/мл), что не позволило авторам оценить дозозависимый эффект этого цитокина на процесс НЕТоза [9].

Кроме того, на способность ИЛ-37 ингибировать НЕТоз могут влиять и другие факторы: концентрация цитокина, время инкубации и индивидуальные особенности доноров. В нашем исследовании мы использовали широкий диапазон концентраций ИЛ-37, с которым нейтрофилы были проинкубированы в течение 4,5 ч. Возможно, для достижения более выраженного эффекта необходима более длительная инкубация, что трудно осуществить для короткоживущих нейтрофилов. Увеличение длительности инкубации приводило к значительному (до ≥ 50 %) увеличению количества погибших нейтрофилов (данные не представлены).

Также на результаты исследования может влиять индуктор НЕТоза и его концентрация. При варьировании индукторов и их концентраций могут наблюдаться различные уровни активации нейтрофилов, а следовательно, различные уровни НЕТоза [11]. В данном исследовании в качестве индуктора НЕТоза мы использовали ФМА в одной концентрации (100 нМ), что могло ограничить вариативность реакции нейтрофилов и, возможно, снизило чувствительность клеток к ИЛ-37. В будущих исследованиях применение других активаторов НЕТоза, например ионофоров кальция или липополисахаридов, может предоставить более точную информацию о влиянии ИЛ-37 на формирование NETs.

Предполагается, что благодаря своим противовоспалительным свойствам ИЛ-37 может использоваться в качестве терапевтического агента для контроля чрезмерного нейтрофильного воспаления, особенно в условиях, связанных с неконтролируемым образованием NETs, таких как аутоиммунные заболевания и сепсис [12, 13].

Представлены убедительные доказательства способности ИЛ-37 уменьшать воспаление, опосредованное нейтрофилами, в различных моделях на лабораторных животных. В ряде работ на модели острого вирусного миокардита у мышей также продемонстрирована способность ИЛ-37 ингибировать НЕТоз [9, 14-17]. Таким образом, в отличие от экспериментов in vitro, в экспериментах на лабораторных животных представлены убедительные доказательства способности ИЛ-37 уменьшать нейтрофильное воспаление и процесс НЕТоза. Такие отличия могут объясняться тем, что модели in vitro не отражают в полной мере сложные взаимодействия, происходящие in vivo, где на образование NETs могут влиять различные клеточные и гуморальные факторы.

Заключение

Таким образом, полученные результаты не подтверждают предположение о том, что ИЛ-37 способен подавлять НЕТоз путем прямого воздействия на нейтрофилы в экспериментах in vitro. Для более глубокого изучения потенциального воздействия ИЛ-37 на эти клетки требуются дополнительные исследования с применением различных стимуляторов НЕТоза и анализа других маркеров активации нейтрофилов.

Литература

1. Masucci M.T., Minopoli M., Del Vecchio S., Carriero M.V. The emerging role of neutrophil extracellular traps (NETs) in tumor progression and metastasis. Front. Immunol. Frontiers Media S.A. 2020; 11: 554635. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.01749

2. Нестерова И.В., Чудилова Г.А., Ковалева С.В., Русинова Т.В., Павленко В.Н., Тараканов В.А., Барова Н.К., Малиновская В.В. Неоднозначное влияние рекомбинантного интерферона α2b на нетрансформированный и трансформированный фенотип функционально значимых субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов в эксперименте in vitro. Иммунология. 2020; 41 (2): 112-24. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-2-124-134

3. Нестерова И.В., Чудилова Г.А., Чапурина В.Н., Ковалева С.В., Ломтатидзе Л.В., Тараканов В.А., Тетерин Ю.В., Пирогова А.И. Дифференцированность иммуномодулирующих эффектов аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинина и глюкозаминилмурамилдипептида на эффекторные функции и фенотип функционально значимых субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов в экспериментальной модели вирусно-бактериальной коинфекции. Иммунология. 2022; 43 (1): 89-102. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-1-89-102

4. Li X., Xiao S., Filipczak N., Yalamarty S.S.K., Shang H., Zhang J., Zheng Q. Role and therapeutic targeting strategies of neutrophil extracellular traps in inflammation. Int. J. Nanomedicine. Dove Press. 2023; 18: 5265-87. DOI: https://doi.org/10.2147/IJN.S418259

5. Никольский А.А., Шиловский И.П., Гудима Г.О., Хаитов М.Р. Роль ИЛ-37 в нейтрофил-опосредованных воспалительных заболеваниях. Иммунология. 2024; 45 (1): 107-15. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-1-107-115

6. Воробьева Н.В., Кондратенко И.В., Вахлярская С.С., Черняк Б.В., Пинегин Б.В. Роль митохондриальной поры в эффекторных функциях нейтрофилов человека. Иммунология. 2020; 41 (1): 42-53. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-1-42-53

7. Потапнев М.П., Гущина Л.М., Мороз Л.А. Фенотипическая и функциональная гетерогенность субпопуляций нейтрофилов в норме и при патологии. Иммунология. 2019; 40 (5): 84-96. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-15009

8. Хаитов М.Р., Дынева М.Е., Савлевич Е.Л., Кудлай Д.А., Гайсина А.Р., Никольский А.А., Шиловский И.П., Курбачева О.М. Бронхиальная астма в сочетании с полипозным риносинуситом: клиническая характеристика и анализ локальной экспрессии гена IL37. Иммунология. 2020; 41 (1): 54-63. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-1-54-63

9. Li B., Cao X., Ai G., Liu Y., Lv C., Jin L., Xu R., Zhao G., Yuan H. Interleukin-37 alleviates myocardial injury induced by coxsackievirus B3 via inhibiting neutrophil extracellular traps formation. Int. Immunopharmacol. 2022; 113: 109343. DOI: https://doi.org/10.1016/j.intimp.2022.109343

10. Jia H., Liu J., Han B. Reviews of interleukin-37: Functions, receptors, and roles in diseases. Biomed. Res. Int. 2018; 2018: 1-14. DOI: https://doi.org/10.1155/2018/3058640

11. Hoppenbrouwers T., Autar A.S.A., Sultan A.R., Abraham T.E., van Cappellen W.A., Houtsmuller A.B., van Wamel W.J.B., van Beusekom H.M.M., van Neck J.W., de Maat M.P.M. In vitro induction of NETosis: Comprehensive live imaging comparison and systematic review. PLoS One / ed. Palaniyar N. Public Library of Science. 2017; 12 (5): e0176472. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0176472

12. Long D., Mao C., Xu Y., Zhu Y. The emerging role of neutrophil extracellular traps in ulcerative colitis. Front. Immunol. Frontiers Media SA. 2024; 15: 1425251. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2024.1425251

13. Gavriilidis E., Divolis G., Kafalis N., Kogias D., Natsi A.M., Antoniadou C., Papadimitriou E., Tsironidou V., Giatromanolaki A., Ritis K., Kouklakis G., Skendros P. P108 Response to vedolizumab in ulcerative colitis is associated with reduced neutrophil extracellular traps formation and IL-1β production: Insights from NEUTROVED study. J. Crohns Colitis. Oxford Academic. 2024; 18: i391-i391. DOI: https://doi.org/10.1093/ecco-jcc/jjad212.0238

14. Yang Y., Zhang Z-X., Lian D., Haig A., Bhattacharjee R.N., Jevnikar A.M. IL-37 inhibits IL-18-induced tubular epithelial cell expression of pro-inflammatory cytokines and renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 2015; 87: 396-408. DOI: https://doi.org/10.1038/ki.2014.295

15. Conti P., Pregliasco F.E., Bellomo R.G., Gallenga C.E., Caraffa A., Kritas S.K., Lauritano D., Ronconi G. Mast cell cytokines IL-1, IL-33, and IL-36 mediate skin inflammation in psoriasis: A novel therapeutic approach with the anti-inflammatory cytokines IL-37, IL-38, and IL-1Ra. Int J Mol Sci. 2021; 22: 8076. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms22158076

16. Conti P., Lauritano D., Caraffa A., Gallenga C.E., Carinci F., Ronconi G., Kritas S.K., Di Emidio P., Martinotti S., Pandolfi F. Mast cells mediate rheumatoid arthritis-inhibitory role of IL-37. Crit. Rev. Immunol. 2019; 39: 267-74. DOI: https://doi.org/10.1615/CritRevImmunol.2020033176

17. Coll-Miró M., Francos-Quijorna I., Santos-Nogueira E., Torres-Espin A., Bufler P., Dinarello C.A., López-Vales R. Beneficial effects of IL-37 after spinal cord injury in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2016; 113: 1411-6. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1523212113

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)