Разработка и валидация методики определения глюкозаминилмурамилдипептида в водных растворах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
РезюмеВведение. Для определения лекарственных средств пептидной природы широко используется метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с градиентным режимом элюирования. Среди опубликованных работ не найдено валидированных методик, пригодных для исследования новых лекарственных форм глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП). В силу существенных недостатков градиентного элюирования при разработке методик ВЭЖХ-анализа рекомендуется избегать применения градиента, предпочитая ему изократическое элюирование.
Цель - разработка и валидация методики количественного определения глюкозами-нилмурамилдипептида в водных растворах с использованием изократического режима элюирования. Эта методика может быть использована при разработке новых лекарственных форм ГМДП.
Материал и методы. Количественное определение ГМДП в растворах проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в изократическом режиме на колонке Mediterranea Sea18 15 × 0,4 см, 5 мкм с использованием элюента состава: ацетонитрил, 25 мМ фосфатный буферный раствор (3:97), рН 7,3; скорости потока 0,7 мл/мин, длины волны детектора 200 нм и температуры термостатируемой колонки 25 °С.
Результаты. Разработанная методика валидирована по следующим характеристикам: специфичность, линейность, правильность, повторяемость (сходимость), промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность, аналитическая область, пригодность хроматографической системы. Методика успешно апробирована на лабораторных образцах трансдермальных терапевтических систем, содержащих ГМДП.
Заключение. Разработана методика количественного определения глюкозаминилмурамилдипептида в водных растворах методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с изократическим элюированием. Пригодность методики подтверждена соответствием основных валидационных характеристик критериям приемлемости. Подтвержденный аналитический диапазон методики составил 0,5-50 мкг/мл. Методика может быть использована в аналитической части доклинических исследований новых лекарственных форм ГМДП.
Ключевые слова:глюкозаминилмурамилдипептид; водные растворы; обращенно-фазовая ВЭЖХ; изократический режим элюирования
Для цитирования: Курсаков С.В., Кузнецова Е.Г., Курылева О.М., Саломатина Л.А., Гурьянова С.В., Борисова О.Ю., Гудима Г.О., Севастьянов В.И. Разработка и валидация методики определения глюкозаминилмурамилдипептида в водных растворах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Иммунология. 2020, 41 (1): 74-82. DOI: 10.33029/0206-4952-2020-41-1-74-82
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Введение
Мурамилпептиды являются фрагментами грам-положительных и грам-отрицательных бактерий. Мурамилпептиды регулярно образуются в кишечнике в процессе жизнедеятельности комменсальной микрофлоры и оказывают эффекторное воздействие на клетки кишечного эпителия, регулируя иммунный гомеостаз не только мукозального слоя, но и всего организма [1]. Рецепторы мурамилпептидов - МОБ2-белки - относятся к рецепторам врожденного иммунитета и обнаружены во всех клетках организма. Активация МОБ2-рецепторов является необходимым условием как для поддержания толерантности к микроорганизмам, населяющим эпителий и слизистые, так и для формирования адекватного иммунного ответа на патогены [2, 3].
Глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП) является одним из наиболее перспективных соединений мурамилпептидного ряда для применения в качестве иммуномодулирующих средств и адъювантов [4]. ГМДП относится к иммуномодуляторам последнего (III) поколения, активирует врожденный и адаптивный иммунитет и оказывает влияние на широкий спектр заболеваний как инфекционной природы [5], так и аллергических заболеваний [6], принимает участие в борьбе организма с опухолями [7], применяется в коррекции иммунодефицитных состояний [8], при псориазе [9], астме [10], оказывает противовоспалительное, репарационное, лейкопоэтическое [11], детоксицирующее и гепатопротекторное действие [12].
ГМДП зарегистрирован в Государственным реестре лекарственных средств под торговым наименованием Ликопид® и выпускается в форме таблеток (регистрационное удостоверение № ЛС-001438). Высокая эффективность и безопасность применения ГМДП, подтвержденные результатами клинических испытаний [13], определяют перспективность разработки его новых лекарственных форм, что, в свою очередь, делает необходимым усовершенствование существующих или поиск новых методов детектирования ГМДП.
Для разделения лекарственных средств пептидной природы чаще используют обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), так как большинство аналитов хорошо растворимы в водных подвижных фазах и ограниченно растворимы в неполярных растворителях [14-16].
В работе R. Frkanec, J. Tomašić [17] хроматографирование ГМДП предложено проводить на колонке Zorbax ODS C18, используя в качестве подвижной фазы смесь ацетонитрил : 50 мМ ацетат аммония (рН 6,0) в градиентном режиме элюирования.
Разделение пептидов, в том числе ГМДП, осуществлено [18] на колонке C18 Vydac с использованием линейного градиента смеси ацетонитрил : 0,1 % водный раствор трифторуксусной кислоты при 214 нм. Колонка Hypersil С18 использована авторами [19] для определения ГМДП в режиме линейного градиента от 0 до 100 % 40 мМ фосфата натрия (рН 4,0), содержащего 20 % метанола. Детектирование проводили при длине волны 202 нм.
Аналог ГМДП, содержащий С-концевой остаток Lys (GMDP-Lys), анализировали на колонке с обращенной фазой Ultrasphere ODS, элюируя 0,1 % аммоний-трифторацетатным буфером (рН 3,5) с градиентом концентрации метанола от 10 до 60 % [20]. Анализируемое соединение элюировалось в виде двух пиков, что объяснялось авторами наличием в растворе двух аномеров по свободному гликозидному гидроксилу. В работе [21] хроматограмма конъюгата GMDP-Lys (AzS), полученная на колонке с обращенной фазой в градиентном режиме, также содержала два пика аномеров ГМДП.
Для изучения динамического равновесия α- и β-аномеров ГМДП в водных растворах была использована обращенно-фазовая ВЭЖХ на колонке Nucleosil C18 с градиентным элюированием смесью 0,05 % раствора трифторуксусной кислоты и 80 % раствора ацетонитрила [22]. Исследование показало, что соотношение аномеров α : β в растворах зависит от продолжительности установления равновесия, природы растворителя и составляет 2,12 в воде при рН 3,7 и выдерживании раствора около 150 мин.
Препаративное разделение аномеров ГМДП позволило изучить их индивидуальные конформационные и биологические свойства [22]. α-Аномер преимущественно приобретает свернутую структуру, стабилизированную внутримолекулярными водородными связями СО --- HN, и является биологически неактивной формой. Биологическая активность ГМДП определяется наличием β-аномера, который образует в водном растворе линейные структуры. Такая α-β-аномерная специфичность молекулы должна учитываться при разработке новых препаратов, содержащих ГМДП.
Описанные методы определения ГМДП использовались для исследования специфического связывания глюкозаминилмурамилпептидов с гистонами [18], очистки конъюгатов ГМДП [21], разделения продуктов ферментативной обработки ГМДП [19], изучения свойств аномеров [22] и т.д. Работ, описывающих условия определения ГМДП, пригодных для исследования новых лекарственных форм ГМДП, не выявлено.
Известные способы детектирования ГМДП в основном относятся к методу обращенно-фазовой хроматографии с градиентным режимом элюирования. Градиентное элюирование, как правило, применяется для проведения скрининговых измерений, а также анализов образцов, содержащих большое число целевых соединений [23]. Выбор между изократическим и градиентным режимами в пользу последнего представляется неоправданным для исследования лекарственных препаратов, содержащих одно или несколько действующих веществ, при условии достаточной селективности разделения основных и вспомогательных веществ. В силу известных недостатков градиентного элюирования [23] при разработке методик ВЭЖХ-анализа рекомендуется избегать применения градиента, предпочитая ему изократическое элюирование.
Целью настоящего исследования стали разработка и валидация методики количественного определения
ГМДП в водных растворах с использованием изократического режима элюирования, которая может быть использована при разработке новых лекарственных форм ГМДП, например, трансдермальной терапевтической системы (ТТС).
Материал и методы
Реактивы, материалы
В работе использовали субстанцию ГМДП (АО "Пептек", Россия), ацетонитрил, метанол, 2-пропанол, трифторуксусную кислоту, муравьиную кислоту, уксусную кислоту, фосфорную кислоту, калия гидрофосфат, калия дигидрофосфат, аммония ацетат, 0,9 % раствор натрия хлорида.
Лабораторные образцы ТТС, содержащие 4,6 мг ГМДП, и лабораторные образцы ТТС, не содержащие ГМДП (плацебо), были изготовлены в асептических условиях "чистой комнаты" (производитель: отдел биомедицинских технологий и тканевой инженерии ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России).
В экспериментах in vitro по изучению диффузии иммуномодулятора из ТТС были использованы кролики-самцы породы Новозеландский белый массой 2-2,5 кг, полученные из питомника лабораторных животных ООО "КролИнфо". После усыпления животного проводили забор лоскута кожи с предварительно удаленным волосяным покровом в области живота, затем удаляли гиподерму. Усыпление проводили с использованием препаратов "Золетил 100" (Virbaс Sante Animale, Франция) и "Рометар" (Bioveta, Чехия). Кожный лоскут использовали сразу после выделения. Все манипуляции с животными проводили согласно правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследований и других научных целей [European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123) Strasbourg, 1986]. Растворители имели квалификацию "для ВЭЖХ", реактивы - квалификацию не ниже "х.ч.".
Оборудование
Исследование проводили на хроматографической системе Agilent 1200 (Agilent Technologies, США), снабженной вакуумным дегазатором G1322A, четырехканальным насосом G1311A, высокопроизводительным автосамплером G1367B, термостатом колонок G1316A, ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны G1314B.
Изучение чрескожной диффузии ГМДП из трансдермальной терапевтической системы проводили с использованием анализатора диффузии препаратов HDT 1000 (Copley Scientific Ltd., Великобритания).
Для пробоподготовки применяли электронные лабораторные весы AF-R220CE (Chinco Denshi Co., Япония), лабораторную центрифугу ЕВА 20 (Andreas Hettich GmbH, Германия), дозаторы переменного объема "Лен-пипет" 0,5-10, 5-50, 20-200 и 100-1000 мкл (Thermo Fisher Scientific, Россия).
Методика пробоподготовки
Образцы, содержащие нерастворимые примеси, предварительно центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин. При необходимости образцы разбавляли раствором элюента до концентраций, входящих в аналитический диапазон методики.
Условия хроматографического анализа
Хроматографическое разделение проводили в изократическом режиме на колонке Mediterranea Sea 18 15 х 0,4 см, 5 мкм (Teknokroma Analitica SA, Испания), с предколонкой размером 8 х 4 мм, заполненной тем же сорбентом. Температура термостата колонки - 25 °С. Объем вводимой пробы - 10 мкл.
Подвижная фаза - смесь ацетонитрил : 25 мМ фосфатный буферный раствор (3 : 97), рН 7,3. Фосфатный буферный раствор готовили смешением 25 мМ раствора К2НР04 с 25 мМ раствором КН2Р04 в соотношении 80 : 20. Элюент предварительно фильтровали и дегазировали на устройстве для фильтрования под вакуумом. Скорость потока подвижной фазы - 0,7 мл/мин.
Детектирование проводили при длине волны 200 нм, соответствующей максимуму поглощения ГМДП. Время хроматографирования - 10 мин, время удерживания аномеров ГМДП - около 3,3 и 4,9 мин.
Регистрация и обработка хроматографических данных выполнены с помощью программного обеспечения Chem Station (Agilent Technologies, США).
Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с ОФС.1.1.0013.15 "Статистическая обработка результатов химического эксперимента" с помощью программного обеспечения Microsoft 0ffice Excel 2010 [24].
Результаты и обсуждение
Разработка метода
Целью этого этапа исследований стало определение оптимальных параметров хроматографического определения ГМДП в водных растворах. Основными критериями при выборе условий анализа служили простота предварительной подготовки проб и элюента, возможность использования изократического режима элюирования, качество основных валидационных характеристик, длительность анализа.
Хроматографирование проводили в режиме обращенно-фазовой и гидрофильной ВЭЖХ с использованием неподвижных фаз различной полярности. В качестве компонентов элюента были изучены ацетонитрил, метанол, 2-пропанол, водные растворы трифторуксусной, муравьиной, уксусной, фосфорной кислот и их соли. Длину волны детектора варьировали в диапазоне 200-225 нм, рН элюента - с 2,0 до 7,5; температуру термостата колонки - от 20 до 60 °С.
Оптимальные параметры хроматографического разделения были получены в изократическом режиме на колонке Mediterranea Sea18 15 х 0,4 см, 5 мкм (Teknokroma Analitica SA, Испания) при использовании элюента состава ацетонитрил : 25 мМ фосфатный буферный раствор (3 : 97), рН 7,3; скорости потока 0,7 мл/мин, длины волны 200 нм и температуры термостата колонки 25 °С.
Предварительная подготовка проб заключалась в центрифугировании образцов, содержащих нерастворимые примеси, а также разбавлении до получения концентраций, входящих в аналитический диапазон методики.
Валидация методики
Валидацию методики проводили в соответствии с ОФС.1.1.0012.15 "Валидация аналитических методик" [25] по следующим характеристикам: специфичность, линейность, правильность, повторяемость (сходимость), промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность, аналитическая область, пригодность хроматографической системы.
Специфичность
Специфичность методики оценивали путем анализа модельных образцов: 0,9 % водного раствора хлорида натрия из приемной камеры диффузионной ячейки, этого же раствора с добавлением ГМДП до получения концентрации 25 мкг/мл и стандартного раствора ГМДП в 0,9 % водном растворе NaCl с концентрацией 25 мкг/мл. Пробы раствора отбирали из приемной камеры диффузионной ячейки, в которой был зафиксирован лоскут кожи кролика с прикрепленным плацебо ТТС, после термостатирования при температуре 32 °С при постоянном перемешивании 400 об/мин в течение 24 часов.
Полученные хроматограммы приведены на рис. 1-3.
![](http://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_immunology,71,,4,photo1,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Рис. 1. Хроматограмма 0,9 % водного раствора хлорида натрия из приемной камеры диффузионной ячейки
![](http://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_immunology,71,,4,photo2,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Рис. 2. Хроматограмма 0,9 % водного раствора хлорида натрия из приемной камеры диффузионной ячейки, содержащего 25 мкг/мл ГМДП
![](http://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_immunology,71,,4,photo3,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Рис. 3. Хроматограмма стандартного раствора ГМПД (С = 25 мкг/мл) в 0,9 % водном растворе хлорида натрия
Хроматограммы растворов ГМДП содержат два пика, что согласуется с данными [19-21] и может объясняться присутствием в растворе двух аномерных форм ГМДП. На хроматограммах холостых образцов 0,9 % раствора хлорида натрия из приемной камеры диффузионной ячейки не наблюдалось пиков со временем удерживания, соответствующим времени удерживания ГМДП. Таким образом, экспериментально подтверждено, что присутствие сопутствующих компонентов и примесей не влияет на результат анализа.
Линейность
Для оценки линейности анализировали 0,9 % растворы NaCl, содержащие 0,5; 1; 5; 10; 25; 50; 75; 100; 150 мкг/мл ГМДП. Экспериментальные данные обрабатывали методом наименьших квадратов с использованием линейной модели. По полученным значениям был построен градуировочный график зависимости суммарной площади пиков аномеров от концентрации ГМДП, приведенный на рис. 4.
![](http://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_immunology,71,,4,photo4,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Рис. 4. Зависимость суммарной площади пиков ГМДП от концентрации
Полученные значения площади пиков в диапазоне от 0,5 до 50 мкг/мл линейно зависят от концентрации; при концентрациях выше 50 мкг/мл линейная зависимость нарушается. В диапазоне от 0,5 до 50 мкг/мл угловой коэффициент b и свободный член а имеют значение 15,55 и -0,314 соответственно. Коэффициент корреляции r равен 0,9999, что удовлетворяет требованиям [25].
Правильность
Правильность валидируемой методики оценивали путем трехкратного анализа стандартных 0,9 % растворов хлорида натрия, содержащих 1, 25, 50 мкг/мл ГМДП. Согласно рекомендациям ICH [26], для оценки правильности использовали критерий открываемости определяемого вещества R, величина которого с учетом доверительного интервала должна находиться в пределах 98-102 %. Открываемость вычисляли по формуле:
![](http://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_immunology,71,,4,photo5,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Результаты оценки правильности методики представлены в табл. 1.
Таблица 1. Результаты оценки правильности методики количественного определения ГМДП в водных средах (n= 9, p < 0,95)
Взято, мкг/мл | Найдено, мкг/мл | Открываемость, R, % |
1 | 0,99 | 99,0 |
0,99 | 99,0 |
1,01 | 101,0 |
25 | 24,82 | 99,3 |
24,91 | 99,6 |
24,79 | 99,2 |
50 | 50,17 | 100,3 |
50,18 | 100,4 |
50,14 | 100,3 |
Среднее значение, % | 99,8 |
Стандартное отклонение, SD, % | 0,7 |
Относительное стандартное отклонение, RSD, % | 0,7 |
Доверительный интервал среднего значения, % | 99,1-100,5 |
В диапазоне измерений 1 - 50 мкг/мл открываемость находится в интервале от 99,0 до 101,0 %, ее средняя величина составляет 99,8 ± 0,7 %, что соответствует критерию правильности методики.
Повторяемость (сходимость)
Повторяемость методики оценивали по результатам, полученным в одинаковых регламентированных условиях в одной лаборатории (один и тот же исполнитель, одно и то же оборудование, один и тот же набор реактивов) в течение короткого промежутка времени. Результаты 6 параллельных испытаний растворов ГМДП приведены в табл. 2.
Таблица 2. Результаты оценки повторяемости методики количественного определения ГМДП в водных растворах (С = 25 мкг/мл, n = 6, p < 0,95)
Результаты анализа, мкг/мл | Средний результат, мкг/мл | Стандартное отклонение, SD, мкг/мл | Относительное стандартное отклонение, RSD, % | Доверительный интервал среднего результата, мкг/мл |
24,82 | 24,87 | 0,06 | 0,24 | 24,81-24,93 |
24,91 |
24,79 |
24,95 |
24,85 |
24,9 |
Относительное стандартное отклонение отдельных результатов не превышает 2,0 % и отвечает требованиям к методикам ВЭЖХ [27].
Промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность
Внутрилабораторную прецизионность методики изучали в условиях работы одной лаборатории. Анализ выполняли два исполнителя в разные дни на одном и том же оборудовании, результаты представлены в табл. 3.
Таблица 3. Результаты оценки промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности методики количественного определения ГМДП в водных растворах (С = 25 мкг/мл, n = 6, p < 0,95)
Исполнитель | Дата | Результаты анализа, мкг/мл | Средний результат, мкг/мл | Стандартное отклонение, SD, мкг/мл | Относительное стандартное отклонение, RSD, % |
Исполнитель 1 | 30.09.19 | 24,82 | 24,83 | 0,06 | 0,25 |
30.09.19 | 24,91 |
30.09.19 | 24,79 |
01.10.19 | 24,74 |
01.10.19 | 24,82 |
01.10.19 | 24,89 |
Исполнитель 2 | 15.10.19 | 24,82 | 24,85 | 0,07 | 0,27 |
15.10.19 | 24,85 |
15.10.19 | 24,78 |
16.10.19 | 24,97 |
16.10.19 | 24,88 |
16.10.19 | 24,82 |
Расчет Д-критерия Фишера показал, что стандартные отклонения результатов анализов, полученных разными аналитиками, статистически эквивалентны. Средние результаты статистически достоверно не отличаются друг от друга (р < 0,95). Промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность методики соответствует требованиям, предъявляемым к этой валидационной характеристике [27].
Аналитическая область
К величине аналитической области методик предъявляется следующее требование: методики количественного определения должны быть применимы в интервале от 80 до 120 % от номинального значения определяемой аналитической характеристики [25]. Поскольку содержание ГМДП в растворах после диффузии может изменяться в широких пределах в зависимости от состава ТТС и условий чрескожного переноса, аналитическую область методики устанавливали по диапазону экспериментальных данных, удовлетворяющих линейной модели.
Интервал концентраций ГМДП, в котором доказан приемлемый уровень правильности и внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности, составил 0,5-50 мкг/мл.
Оценка пригодности хроматографической системы
В соответствии с [28] для оценки пригодности системы проводили определение следующих параметров:
- эффективность хроматографической системы, рассчитанная по ширине пика на половине высоты;
- фактор асимметрии (фактор симметрии) пика, определенный по ширине пика на 5 % его высоты;
- разрешение между пиками аномерных форм ГМДП, рассчитанное с использованием ширины пиков на половине высоты;
- относительное стандартное отклонение значений площади пика.
Основные параметры хроматографической системы рассчитывали из хроматограмм стандартного раствора ГМДП с концентрацией 25 мкг/мл после его 6-кратного анализа. Результаты определения представлены в табл. 4.
Таблица 4. Основные параметры хроматографического анализа стандартного раствора ГМДП в 0,9 % водном растворе NaCl (С = 25 мкг/мл, n = 6, р < 0,95)
Параметр | Значение | Требование [16, 18] |
Эффективность хроматографической системы, число теоретических тарелок | 7223 (пик 1) 4694 (пик 2) | не менее 2000 |
Фактор асимметрии (фактор симметрии) пиков | 1,25 (пик 1) 1,08 (пик 2) | 0,8-1,5 |
Разрешение между пиками | 7,6 | не менее 1,5 |
Относительное стандартное отклонение значений площади пиков, % | 0,21 (пик 1) 0,17 (пик 2) | 0,42 |
Полученные результаты доказывают пригодность хроматографической системы и разработанной методики для количественного определения ГМДП в водных растворах.
Проверка возможности использования методики для исследования чрескожной диффузии ГМДП in vitro
Разработанная методика ВЭЖХ-определения ГМДП в водных растворах была апробирована в ходе изучения его чрескожной диффузии из трансдермальной терапевтической системы.
Кожу кролика с прикрепленным лабораторным образцом ТТС, содержащим ГМДП, или образцом плацебо фиксировали между фланцами донорской и приемной камер диффузионной ячейки. Приемную камеру заполняли 0,9 % водным раствором хлорида натрия. Ячейку помещали в анализатор диффузии препаратов и термостатировали при температуре 32 °С и постоянном перемешивании со скоростью 400 об/мин. По истечении 24 часов отбирали пробы раствора из приемной камеры и анализировали по разработанной методике.
Правильность методики в условиях эксперимента in vitro оценивали методом добавок с использованием критерия открываемости определяемого вещества R. Для этого анализировали пробы раствора из приемной камеры ячеек с образцами ТТС, содержащимиГМДП, до и после введения в пробы известного количества аналита. В качестве холостых проб использовали растворы из приемной камеры ячеек с образцами ТТС, не содержащими ГМДП. При необходимости анализируемые пробы разбавляли до концентраций, соответствующих аналитической области методики.
Результаты исследования представлены в табл. 5.
Таблица 5. Результаты оценки правильности методики определения ГМДП в условиях эксперимента in vitro (n = 9, p < 0,95)
Введено, мкг/мл | Найдено, мкг/мл | Открываемость, R, % |
200 | 201,6 | 100,8 |
198,0 | 99,0 |
200,0 | 100,0 |
210 | 211,1 | 100,5 |
211,3 | 100,6 |
211,2 | 100,6 |
280 | 283,9 | 101,4 |
284,7 | 101,7 |
284,1 | 101,5 |
Среднее значение, % | 100,7 |
Стандартное отклонение, SD, % | 0,8 |
Относительное стандартное отклонение, RSD, % | 0,8 |
Доверительный интервал среднего значения, % | 99,9-101,5 |
Отклонение результатов, полученных с использованием разработанной методики, от фактических значений не превышает 2 % и отвечает требованиям [26].
Таким образом, полученные результаты подтверждают возможность применения предлагаемой методики для определения концентрации ГМДП в водных растворах при проведении доклинических исследований новых лекарственных форм.
Заключение
Разработана методика количественного определения глюкозаминилмурамилдипептида в водных растворах методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с изократическим элюированием. Пригодность методики подтверждена соответствием основных валидационных характеристик критериям приемлемости. Подтвержденный аналитический диапазон методики составил 0,5-50 мкг/мл. Методика может быть применена для проведения аналитической части доклинических исследований новых лекарственных форм и композиций с ГМДП.
Литература
1. Philpott D.J., Sorbara M.T., Robertson S.J., Croitoru K., Girardin S.E. NOD proteins: regulators of inflammation in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 2014; 14 (1): 9-23. DOI: 10.1038/nri3565.
2. Fritz J.H., Ferrero R.L., Philpott D.J., Girardin S.E. Nod-like proteins in immunity, inflammation and disease. Nat. Immunol. 2006; 7 (12): 1250-7.
3. Caruso R., Warner N., Inohara N., Núñez G. Immunity. NOD1 and NOD2: signaling, host defense, and inflammatory disease. Immunity. 2014; 41 (6): 898-908.
4. Манапова Э.Р., Фазылов В.Х., Гурьянова С.В. Цитопении и их коррекция при противовирусной терапии хронического гепатита С у пациентов с генотипом 1. Вопросы вирусологии. 2017; 62 (4): 174-8.
5. Колесникова Н.В., Козлов И.Г., Гурьянова С.В., Коков Е.А., Андронова Т.М. Клинико-иммунологическая эффективность и перспективы использования мурамилдипептидов в лечении атопических заболеваний. Медицинская иммунология. 2016; 18 (1): 15-20.
6. Козлов И.Г., Воронина Е.В., Валякина Т.И., Симонова М.А., Гурьянова С.В., Мещерякова Е.А., Андронова Т.М. Ликопид в иммунотерапии опухолей: обзор экспериментальных исследований (обзор литературы). Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2011; 10 (2): 32-8.
7. Лусс Л.В. Вторичные иммунодефицитные состояния у детей. Взгляд клинициста к назначению иммуномодулирующей терапии. Аллергология и иммунология в педиатрии. 2018; № 4 (55): С. 4-18.
8. Guryanova S., Udzhukhu V., Kubylinsky A. Pathogenetic therapy of psoriasis by muramyl peptide. Front. Immunol. 2019; 10: 1275-83. DOI: 10.3389/fimmu.2019.01275.
9. Гурьянова С.В., Козлов И.Г., Мещерякова Е.А., Алексеева Л.Г., Андронова Т.М. Глюкозаминилмурамилдипептид нормализует баланс Тh1/Th2 при атопической бронхиальной астме. Иммунология. 2009; 30 (5): 305-8.
10. Ушкалова Е.А., Зырянов С.К., Затолочина К.Э. Соединения на основе мурамилпептидов в современной медицине: фокус на глюкозаминилмурамилдипептид. Терапевтический архив. 2019; 12: 122-7.
11. Guryanova S., Andronova T., Kozlov I. The role of NOD2 ligands muramyl peptides in chemotherapy induced cytopenia. Eur. J. Immunol. 2019; 49 (suppl 3): 1229.
12. Иммунотерапия : руководство для врачей. 2-е изд., перераб. и доп. Р.М. Хаитов, Р.И. Атауллаханов, А.Е. Шульженко (ред.). Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2018: 768 с. ISBN: 978-5-9704-4378-1.
13. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Андронова Т.М. Отечественные иммунотропные лекарственные средства последнего поколения и стратегия их применения. Лечащий врач. 1998. № 4. С. 46-51.
14. Aguilar M.-I. HPLC of peptides and proteins: basic theory and methodology. Methods Mol. Biol. 2004; 251: 3-9.
15. Mant C., Chen Y., Yan Z., Popa T., Kovacs J., Mills J., Tripet B., Hodges R. HPLC analysis and purification of peptides. Methods Mol. Biol. 2007; 386: 3-55. DOI: 10.1007/978-1-59745-430-8_1.
16. Carr D. A Guide to the Analysis and Purification of Proteins and Peptides by Reversed-Phase HPLC. Aberdeen : Advanced Chromatography Technologies, 2002: 64 p.
17. Frkanec R., Tomašić J. High performance liquid chromatography in analysis of compounds comprising the elements of bacterial peptidoglycan structure with immunological activity. J. Liq. Chromatogr. Relat. Tech. 2007; 31 (1): 107-33. DOI: 10.1080/10826070701665709.
18. Golovina T., Fattakhova G., Swiderek K., Makarov E., Bovin N., Shively J., Nesmeyanov V. Specific binding of glucosaminylmuramyl peptides to histones. FEBS Lett. 1999; 454 (12): 152-6. DOI: 10.1016/S0014-5793(99)00689-4.
19. Psylinakis E., Boneca I., Mavromatis K., Deli A., Hayhurst E., Foster S., Varum K., Bouriotisa V. Peptidoglycan N-acetylglucosamine deacetylases from Bacillus cereus, highly conserved proteins in Bacillus anthracis. J. Biol. Chem. 2005; 280 (35): 30 856-63. DOI: 10.1074/jbc.M407426200.
20. Кайдалов А.А., Уткин Ю.Н., Андронова Т.М., Цетлин В.И., Иванов В.Т. Специфическое связывание мурамилпептидов с мембранами мозга крысы. Биоорганическая химия. 1987; 13 (11): 1523-9.
21. Golovina T.N., Sumaroka M.V., Samokhvalova L.V., Andronova T.M., Nesmeyanov V.A. Biochemical characterization of glucosaminylmuramyldipeptide binding sites of murine macrophages. FEBS Lett. 1994;356 (1): 9-12. DOI: 10.1016/0014-5793(94)01219-9.
22. Meshcheryakova E., Mineev K., Volynski P., Andronova T., Ivanov V. GMDP: unusual physico-chemical and biological properties of the anomeriс forms. J. Pept. Sci. 2015; 21 (9): 717-22. DOI: 10.1002/psc.2796.
23. Сычев К.С. Практический курс жидкостной хроматографии. Кокоро, 2013: 272 c.
24. ОФС.1.1.0013.15. Статистическая обработка результатов химического эксперимента. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Москва, 2018; 1: 289-318.
25. ОФС.1.1.0012.15. Валидация аналитических методик. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Москва, 2018; 1: 276-88.
26. ICH Harmonised Tripartite Guideline. Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology. Q2(R1). Geneva, 2005: 13 p.
27. Эпштейн Н.А. Оценка пригодности (валидация) ВЭЖХ-методик в фармацевтическом анализе (обзор). Химико-фармацевтический журнал. 2004; 38 (4): 40-56.
28. ОФС.1.2.1.2.0001.15. Хроматография. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Москва, 2018; 1: 845-72.