Введение
Лимфопения, в том числе затрагивающая Т-лимфоциты, развивается при разнообразных внешних воздействиях на организм (ионизирующие излучения, химические агенты, инфекции и пр.) [1]. При прекращении действия повреждающих факторов количество лимфоцитов и их субпопуляций в крови возвращается к норме. Восстановление количества Т-лимфоцитов происходит за счет двух механизмов: тимопоэза в тимусе и гомеостатической пролиферации в периферическом отделе иммунной системы [1, 2].
Химиотерапевтические препараты, которые применяют в медицине в первую очередь для лечения онкологических заболеваний, относятся к группе факторов, которые способствуют атрофии тимуса и уменьшению пула циркулирующих лимфоцитов [2-4]. Алкилирующие цитостатики (в частности циклофосфан) вызывают повреждение генетического аппарата активно делящихся клеток, что приводит к апоптозу как опухолевых клеток, так и иммунокомпетентных клеток в лимфоидных органах [3]. В проведенных ранее исследованиях при изучении действия циклофосфана в терапевтических дозах был установлен его выраженный иммуносупрессивный эффект, наиболее сильно затрагивающий Т-клеточное звено иммунной системы [1, 2, 5-7]. Этот эффект проявлялся при применении циклофосфана как в дозе 20 мг/кг (уменьшение количества Т-лимфоцитов на 50 %), так и в режиме высокодозовой химиотерапии - 200 мг/кг (снижение числа Т-клеток на 90 %) [6].
После воздействия цитостатиков число Т-клеток восстанавливается за счет усиления тимопоэза и гомеостатической пролиферации [2]. При этом тимопоэз можно рассматривать в качестве нормального способа восстановления дефицита Т-лимфоцитов, сохраняющего качественные характеристики периферических Т-клеток и полноценный репертуар T- клеточных рецепторов (TCR), а гомеостатическую пролиферацию - в качестве вынужденной меры, ведущей к конверсии фенотипа наивных Т-клеток (Tnaïve), клональной экспансии и сужению репертуара TCR [7-9].
Оценка вклада каждого из этих механизмов в регенерацию Т-клеточного звена иммунной системы при различных патологических состояниях, сопровождающихся Т-клеточным дефицитом (в частности после воздействия цитостатических препаратов), имеет важное значение как для понимания патогенеза этих состояний, так и для поиска адекватных методов их коррекции. В частности, в ряде исследований показано, что иммуномодуляторы различной природы способны восстанавливать количественный и субпопуляционный состав лимфоидных клеток после действия цитостатиков [10-13].
Несмотря на длительную историю изучения циклофосфана и его побочных эффектов на иммунную систему до последнего времени не уделялось достаточного внимания исследованию спонтанного восстановления Т-клеточного звена иммунной системы после воздействия цитостатика. В данной работе мы исследовали вклад тимуса и периферического отдела иммунной системы (на примере селезенки) в восстановление популяции Т-клеток после воздействия цитостатика (циклофосфан) в терапевтической дозе.
Материал и методы
Исследование проводилось на мышах линии C57BL/6 в возрасте 6-8 нед, самках массой 18-20 г, полученных из питомника "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Все манипуляции с экспериментальными мышами осуществляли в соответствии с правилами лабораторной практики ["Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях" (ETS N123), приказ Минздравсоцразвития РФ от 23.08.2010 № 708н "Об утверждении правил лабораторной практики" и "Положение об этическом отношении к лабораторным животным "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России].
Экспериментальной группе животных вводили цик-лофосфан (препарат Циклофосфан-ЛЭНС®) внутрибрюшинно в дозе 125 мг/кг однократно (доза, используемая при терапии опухолей) [14-17]. Мышей забивали на 10, 20, 30 и 60-е сутки после введения препарата (по 5 мышей в каждой группе). Контролем служили мыши соответствующего возраста и того же помета, что и мыши экспериментальной группы, без введения циклофосфана (8 мышей, по 2 мыши в каждой точке исследования). Поскольку мыши контрольной группы в каждой точке исследования (10, 20, 30 и 60-е сутки) статистически значимо не отличались между собой по содержанию Т-лимфоцитов, при анализе полученных результатов они были объединены в одну группу ("Контроль").
Мышей забивали цервикальной дислокацией. Извлекали тимус и селезенку, освобождали от соединительной ткани и гомогенизировали, эритроциты лизировали буфером фирмы eBioscience (США). Для дальнейшего анализа субпопуляционного состава лимфоидных органов полученные суспензии клеток переводили в фосфатно-солевой буфер (ФСБ) c 1,0 % BSA и 0,1 % NaN3. Количество клеток в органах и их жизнеспособность определяли в камере Горяева, предварительно окрасив суспензию эозином. Для определения поверхностных маркеров клетки инкубировали с моноклональными антителами в течение 30 мин при 4 °С. Лазерную цитометрию клеток выполняли на проточном цитометре BD FACSCanto™ II (Becton Dickinson, США) в стандартном режиме. Данные анализировали с помощью программного обеспечения BD FACSDiva и FCS Express (США).
В настоящем исследовании определяли общее содержание клеток, процент и абсолютное содержание Т-лимфоцитов (CD3+) и их основных субпопуляций [суммарной фракции CD4+-Т-хелперов, включающей регуляторные Т-клетки, цитотоксических CD8+-Т-лимфоцитов (ЦТЛ)], а также возрастной фенотип Т-клеток, который оценивали по содержанию Tnaïve и центральных Т-клеток памяти (Tcm).
Использовали следующие комбинации моноклональных антител фирмы eBioscience (США) (препараты для изотипических контролей той же фирмы):
1. Анти-CD3-FITC + анти-CD4-PerCP-Cy5.5 + анти-CD8-APC-eFluor780 + анти-CD44-PE-Cy7 + анти-CD25-APC (тимус).
2. Анти-CD3-FITC + анти-CD4-PerCP-Cy5.5 + анти-CD8-APC-eFluor780 + анти-CD44-PE-Cy7 + анти-СD62L-PE (селезенка).
Статистическую обработку результатов проводили методами непараметрического анализа. Исследованные данные представляли в виде Ме (LQ-UQ), где Ме - медиана, LQ - нижний квартиль, UQ - верхний квартиль. Для сопоставления экспериментальных групп с контролем применяли U-критерий Манна-Уитни, при этом различие групп полагали статистически значимым при р < 0,05. Обработку проводили с помощью программного пакета Statistica 12.5 (Stat Soft Inc., США).
Результаты
На рис. 1 в графической форме показана динамика изменения общего числа клеток в тимусе и селезенке мышей линии C57BL/6 после однократного введения циклофосфана в терапевтической дозе. Результаты представлены как нормализованные данные относительно интактного контроля, принятого за единицу. В тимусе число клеток было минимально на 10-е сутки после введения препарата и составляло 60,00 млн (57,0066,00 млн) клеток при 162,80 млн (142,30-183,00 млн) клеток в контроле, т. е. снижение до 37 % от показателей интактного контроля (р < 0,05; табл. 1). На 20-е сутки общая численность тимоцитов восстанавливалась, достигнув уровня контроля.
&hide_Cookie=yes)
Рис. 1. Динамика изменения общей численности клеток тимуса и селезенки мышей линии C57BL/6 после однократного введения циклофосфана
Здесь и на рис. 2-4, 6, 8: нормализованные относительно контроля данные, медианы соответствующих показателей в контроле приняты за единицу.
Здесь и на рис. 2-4, 6-8: * p < 0,05 в сравнении с контролем.
Таблица 1. Численность тимоцитов у мышей линии C57BL/6 после однократного введения циклофосфана, млн клеток на орган (тимус)
&hide_Cookie=yes)
Примечание. Здесь и в табл. 2-4: * - р <0,05 в сравнении с интактным контролем.
Здесь и в табл. 3: DN- двойные негативные; DP - двойные позитивные; SP - одинарно позитивные тимоциты.
В селезенке клеточность снижалась более постепенно, достигая минимальных значений к 20-м суткам: 60,50 млн (56,50-64,50 млн) клеток при 127,88 млн (118,5-139,5 млн) клеток в контроле (р < 0,05; табл. 2). Восстановление численности лимфоцитов селезенки происходило только к 60-м суткам после введения циклофосфана.
Таблица 2. Численность основных Т-клеточных субпопуляций в селезенке мышей линии C57BL/6 после однократного введения циклофосфана, млн клеток на орган
&hide_Cookie=yes)
Примечание. ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты.
Динамика восстановления отдельных популяций тимоцитов представлена на рис. 2. На 10-е сутки после введения циклофосфана отмечалось статистически значимое снижение численности всех популяций тимоцитов, кроме двойных негативных (DN) тимоцитов (р > 0,05). К 20-м суткам популяции двойных позитивных (DP) и CD4+-тимоцитов практически достигали уровня контроля, а популяции DN- и одинарно позитивных (SP) CD8+-тимоцитов превышали его, вернувшись к нормальным показателям через 2 мес после введения цитостатика (см. табл. 1; рис. 2).
&hide_Cookie=yes)
Рис. 2. Динамика изменения численности основных популяций тимоцитов мышей линии C57BL/6 после однократного введения циклофосфана
Здесь и на рис. 3: DN - двойные негативные; DP - двойные позитивные; SP - одинарно позитивные тимоциты.
Исследование субпопуляций DN-тимоцитов выявило их статистически значимое снижение на 10-е сутки в сравнении с интактным контролем (табл. 3; рис. 3). Увеличение общего содержания DN-тимоцитов на 20-е и 30-е сутки связано с ростом уровня тимоцитов, находящихся на последней стадии дифференцировки -DN4: 6,62 млн клеток (2,38-9,81 млн) и 2,13 млн клеток (1,65-2,27 млн) против 0,62 млн клеток (0,48-0,71 млн) в контроле соответственно (р < 0,05).
&hide_Cookie=yes)
Рис. 3. Динамика изменения численности субпопуляций DN-тимоцитов мышей линии C57BL/6 после однократного введения циклофосфана
Таблица 3. Численность субпопуляций DN-тимоцитов у мышей линии C57BL/6 после однократного введения циклофосфана, млн клеток на орган (тимус)
&hide_Cookie=yes)
Оценка восстановления периферических Т-клеток в селезенке выполнена отдельно для Т-хелперов (фенотип CD3+CD4+) и цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) (фенотип CD3+CD8+). Оценивались динамика восстановления обеих Т-клеточных популяций и их возрастной фенотип.
После введения циклофосфана численность обеих популяций в селезенке снижалась (см. табл. 2; рис. 4). Минимальное значение числа Т-хелперов и ЦТЛ отмечалось на 20-е сутки: 12,61 млн (12,17-13,29 млн) клеток при 26,17 млн (23,93-29,41 млн) клеток в контроле для Т-хелперов и 6,55 млн (6,16-7,28 млн) клеток при 24,9 млн (24,38-26,26 млн) клеток в контроле для ЦТЛ. Количество последних снижалось более выраженно и быстро: уже на 10-е сутки оно составило 54 % от уровня интактного контроля (р < 0,05). Восстановление численности обеих популяций начиналось с 30-х суток.
&hide_Cookie=yes)
Рис. 4. Динамика изменения численности основных популяций лимфоцитов селезенки мышей линии C57BL/6 после однократного введения циклофосфана
ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты.
К 60-м суткам количество Т-хелперов полностью восстанавливалось. В то же время уровень ЦТЛ не восстанавливался даже через 2 мес после введения циклофосфана: 18,97 млн (13,58-20,45 млн) клеток при 24,9 млн (24,38-26,26 млн) клеток в контроле (р < 0,05).
Исследование возрастного фенотипа у мышей проводилось по коэкспрессии поверхностных маркеров CD44 и CD62L: Tnaïve - фенотип CD62L+44low/-, а Tcm - CD62L+44high (рис. 5).
&hide_Cookie=yes)
Рис. 5. Алгоритм цитометрического определения субпопуляций наивных и центральных Т-клеток памяти на примере ЦТЛ селезенки интактной мыши линии C57BL/6
Выявлено, что численность Tnaïve, как и всей популяции в целом, снижалась до 20 сут после введения химиопрепарата (табл. 4, рис. 6). Снижение численности Т-хелперов с фенотипом Tcm начиналось только после 10-х суток, достигая минимальных значений на 30-е сутки, и было менее выраженно, чем Tnaïve - 51 % и 29 % от уровня интактного контроля соответственно.
&hide_Cookie=yes)
Рис. 6. Динамика изменения численности возрастных субпопуляций Т-хелперов мышей линии C57BL/6 после однократного введения циклофосфана
Здесь и на рис. 7, 8: Tnaïve - наивные Т-клетки; Tcm - центральные Т-клетки памяти.
Таблица 4. Численность основных возрастных субпопуляций Т-хелперов (CD4+) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+) в селезенке мышей линии C57BL/6 после однократного введения циклофосфана, млн клеток на орган
&hide_Cookie=yes)
Примечание. Tnaïve - наивные Т-клетки; Tcm - центральные Т-клетки памяти.
Дальнейшее восстановление численности возрастных субпопуляций Т-хелперов происходило с преобладанием лимфоцитов с фенотипом Tcm: на 60-е сутки их содержание составляло 1,51 млн (0,84-1,59 млн) клеток при 0,79 млн (0,68-0,96 млн) клеток в контроле. Численность Tnaïve даже через 2 мес после введения циклофосфана не достигала уровня контроля: 13,94 млн (9,1-15,38 млн) клеток при содержании 20,33 млн (16,27-21,64 млн) клеток у интактных мышей (р < 0,05). Эта тенденция наглядно продемонстрирована на графике изменения соотношения числа Tnaïve и Tcm - Tnaïve/Tcm, которое у Т-хелперов статистически значимо снижалось с 23,6 (показатель интактных мышей) до 10,4 на 60-е сутки после введения циклофосфана (р < 0,05; рис. 7).
&hide_Cookie=yes)
Рис. 7. Изменение соотношения наивных и центральных Т-клеток памяти среди Т-хелперов (CD4+) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+) в селезенке мышей линии C57BL/6 на 60-е сутки после однократного введения циклофосфана
Восстановление численности возрастных субпопуляций ЦТЛ с преобладанием лимфоцитов с фенотипом Tcm выявлялось лишь в конце восстановления численности обеих субпопуляций - в период с 30-х по 60-е сутки после назначения циклофосфана (табл. 4, рис. 8). На 60-е сутки содержание лимфоцитов с фенотипом Tcm составляло 4,29 млн (3,18-5,07 млн) клеток при 3,44 млн (3,24-4,51 млн) клеток у интактных мышей. Численность наивных ЦТЛ, как и наивных Т-хелперов, через 60 дней после введения цитостатика не достигала уровня контроля: 11,82 млн (7,55-12,01 млн) клеток при 15,45 млн (13,3-16,1 млн) клеток в контроле (р < 0,05). При этом соотношение численности ЦТЛ с фенотипами Tnaïve и Tcm так же, как и у Т-хелперов, снижалось с 3,9 у интактных мышей до 2,4 у животных на 60-е сутки после введения цитостатика, отличие статистически значимо (р < 0,05; см. рис. 7).
&hide_Cookie=yes)
Рис. 8. Динамика изменения численности возрастных субпопуляций цитотоксических Т-лимфоцитов мышей линии C57BL/6 после однократного введения циклофосфана
Обсуждение
При исследовании клеточности лимфоидных органов было показано, что тимоциты быстрее реагируют на токсическое действие циклофосфана: уже на 10-е сутки их количество статистически значимо упало до 1/3 от показателей интактного контроля с последующим восстановлением начиная с 20-х суток. Результаты подтверждаются предыдущими исследованиями морфологической структуры тимуса, в которых показано, что при введении циклофосфана наблюдается тимическая атрофия с уменьшением размеров органа и обеднением морфологии долек с миелометапластическими изменениями в субкапсулярной и кортико-медуллярной зонах, увеличением количества апоптотических клеток с фрагментированной ДНК [1, 18, 19]. В то же время численность лимфоцитов селезенки к 10-м суткам снизилась менее существенно и только к 20-м суткам их количество стало значимо отличаться от показателей интактных мышей, достигнув 47 % от их уровня. Следовательно, можно говорить о более высокой чувствительности активно пролиферирующих тимоцитов к действию циклофосфана по сравнению со зрелыми клетками селезенки, а также, ввиду быстрого восстановления тимопоэза, об отсутствии выраженного токсического действия цитостатика на гемопоэтические предшественники тимоцитов и строму центральных органов иммунной системы (костного мозга и тимуса). Отсрочка восстановления количества лимфоцитов селезенки указывает на зависимость этого процесса от лимфопоэза, идущего в центральных органах иммунной системы.
При исследовании динамики восстановления отдельных популяций тимоцитов (DN, DP, SP CD4+ и CD8+) было показано, что их содержание статистически значимо снизилось в ранние сутки после введения циклофосфана (за исключением популяции DN-тимоцитов, уровень снижения которой не был статистически значимым). Похожие результаты были получены в работе R. Frawley и соавт., которые показали, что циклофосфан, как и ряд других иммуносупрессивных препаратов, вызывает атрофию тимуса с прямым повреждающим действием на развивающиеся CD3+-, CD4+CD8+-, CD4+-и CD8+-тимоциты [5]. К 20-м суткам численность всех популяций тимоцитов достигла уровня контроля, а популяции DN- и CD8+-SP-тимоцитов на 20-е и 30-е сутки даже значимо превзошли уровень интактного контроля, вернувшись к нормальным показателям на 60-е сутки. С другой стороны, анализ отдельных субпопуляций DN-тимоцитов показал, что, в отличие от суммарной популяции, снижение численности для каждой из них на 10-е сутки оказалось статистически значимым, а рост на 20-е и 30-е сутки обусловлен чрезмерным увеличением количества DN4-тимоцитов, что косвенно указывает на более высокую интенсивность восстановительных процессов в костном мозге по сравнению с тимопоэзом, который не справляется с дифференцировкой всех поступающих предшественников, формируя своеобразный блок дифференцировки на стадии DN4.
Таким образом, можно констатировать, что после однократного введения циклофосфана в терапевтических дозах происходит кратковременное угнетение тимопоэза, которое к 20-м суткам полностью устраняется и даже сопровождается компенсаторным усилением дифференцировки, в частности популяции CD8+-SP-тимоцитов. В то же время восстановление тимопоэза несколько отстает от восстановления лимфопоэза, идущего в костном мозге, что может свидетельствовать или о меньшей чувствительности гемопоэтических стволовых клеток и стромы костного мозга к повреждающему действию циклофосфана, или, в целом, о более высоком регенеративном потенциале костного мозга по сравнению с тимусом.
После введения циклофосфана численность как Т-хелперов, так и ЦТЛ в селезенке стала постепенно снижаться, достигнув минимальных значений на 20-е сутки, причем снижение ЦТЛ было более выраженным и быстрым, а Т-хелперы оказались более устойчивыми к действию циклофосфана (снижение их численности стало статистически значимым только на 20-е сутки). В опубликованных ранее работах проводилось исследование клеточного состава селезенки и периферической крови в ранние сроки после введения циклофосфана мышам линии Balb/c [20, 21]. Авторами было показано, что в ранние сроки (исследование проводилось начиная с 4-го часа после введения препарата) отмечалось статистически значимое снижение количества CD4+-лимфоцитов, в то время как изменения количества CD8+-клеток не наблюдалось; авторы отмечали восстановление исходных показателей лимфоидного ростка
на 5-7-е сутки после введения цитостатика [20]. В работе X.H. Huyan и соавт. также было показано, что при введении циклофосфана мышам в дозах 100 и 150 мг/кг отмечалось дозозависимое снижение количества CD3+- и CD4+-лимфоцитов и увеличение количества CD8+-клеток на 4-й день после введения химиопрепарата [21].
В нашем исследовании восстановление численности обеих популяций лимфоцитов началось с 30-х суток и полностью завершилось для Т-хелперов на 60-е сутки после введения цитостатика, тогда как ЦТЛ полностью не восстановили свою численность даже к 60-м суткам, достигнув только 76 % от уровня контроля, несмотря на полное восстановление CD8+-SP-популяции в тимусе. Таким образом, можно утверждать, что ЦТЛ являются более уязвимой популяцией при назначении цикло-фосфана в терапевтических дозировках по сравнению с Т-хелперами: восстановление их численности требует большего времени и не компенсируется полностью восстановленным тимопоэзом.
Вторым существенным механизмом поддержания и восстановления численности периферических Т-клеток является гомеостатическая пролиферация, которая при значительном своем повышении в условиях Т-лимфопении ведет к конверсии фенотипа Tnaïve. Последний феномен заключается в приобретении Tnaïve фенотипа Tcm в отсутствие контакта с антигеном. Оценив их соотношение, можно судить о вкладе тимопоэза и гомеостатической пролиферации в процесс восстановления популяций периферических Т-лимфоцитов [1, 2].
Восстановление численности возрастных субпопуляций Т-хелперов проходило с явным преобладанием лимфоцитов с фенотипом Tcm, уровень которых на 60-е сутки после введения препарата почти в 2 раза превышал уровень интактного контроля, тогда как численность наивных Т-хелперов достигла только 69 % от показателя нормальных мышей.
При анализе возрастных субпопуляций ЦТЛ селезенки после введения циклофосфана тенденция к преобладанию лимфоцитов с фенотипом Тст памяти начинала прослеживаться только в конце восстановления численности обеих субпопуляций.
Таким образом, анализ спектра Tnaïve и Т-клеток памяти в популяции Т-лимфоцитов регенерирующих лимфоидных органов свидетельствует о высокой эффективности восстановления Т-клеток памяти и неполноценности этого процесса для Tnaïve. Однако по всей вероятности значительный (если не основной) вклад в восстановление Т-клеток памяти (по крайней мере их центральной фракции) вносит не их пролиферация, а формирование за счет конверсии фенотипа пролиферирующих Tnaïve.
Анализ возрастного фенотипа периферических Т-клеток указывает на существенный вклад гомеостатической пролиферации в восстановление численности как Т-хелперов, так и ЦТЛ, а также на обусловленный этим процессом абсолютный и относительный рост числа клеток с фенотипом Tcm у мышей линии C57BL/6 после однократного введения циклофосфана в терапевтической дозировке.
Заключение
Подводя итог исследования, можно констатировать, что циклофосфан оказывает выраженное цитотоксическое действие на Т-клеточное звено иммунной системы мышей линии C57BL/6 с преимущественным поражением быстро делящихся популяций тимоцитов. Препарат в меньшей степени затрагивает гемопоэтические стволовые клетки и строму центральных лимфоидных органов - костного мозга и тимуса. Восстановление Т-клеточного звена иммунной системы начинается с центральных лимфоидных органов: нормализации лимфо- и тимопоэза. Однако уровень повреждения периферических Т-клеток оказывается таким глубоким, что восстановившийся к 20-м суткам тимопоэз не способен компенсировать дефицит Т-клеточных популяций как минимум в течение 60 сут после однократного введения циклофосфана. Сохраняющийся дефицит периферических Т-лимфоцитов, в свою очередь, ведет к усилению гомеостатической пролиферации и конверсии фенотипа Tnaïve и накоплению Т-хелперов и ЦТЛ с фенотипом Tcm. Клональная экспансия периферических Т-клеток ведет к сужению репертуара Т-клеточных рецепторов, возможному накоплению аутоагрессивных клонов и преждевременному старению иммунной системы, что необходимо учитывать при назначении циклофосфана в терапевтических целях.
Вклад авторов
Концепция и дизайн исследования - Митин А.Н., Марзанова С.Н., Донецкова А.Д.; сбор и обработка материала - Гринько Е.К., Мухина Е.А., Андреева О. С., Шарова Н.И.; анализ цитометрических данных - Литвина М.М.; статистическая обработка - Гринько Е.К., Комогорова В. В.; написание и редактирование текста -Донецкова А. Д.
Литература
1. Ярилин А.А. Гомеостатические процессы в иммунной системе. Контроль численности лимфоцитов. Иммунология. 2004; 25 (5): 312-20.
2. Williams K.M., Hakim F.T., Gress R.E. T cell immune reconstitution following lymphodepletion. Semin. Immunol. 2007; 19 (5): 318-30. DOI: https://doi.org/10.1016/j.smim.2007.10.004
3. ten Berge R.J., Schellekens P.T. Immunosuppressive drugs in clinical medicine. Neth. J. Med. 1994; 45 (6): 329-38.
4. Ito K., Okamoto M., Inaguma Y. et al. Influence of R-CHOP Therapy on immune system restoration in patients with B-Cell lymphoma. Oncology. 2016; 91 (6): 302-10. DOI: https://doi.org/10.1159/000449251
5. Frawley R., White K. Jr., Brown R. et al. Gene expression alterations in immune system pathways in the thymus after exposure to immunosuppressive chemicals. Environ. Health Perspect. 2011; 119 (3): 371-6. DOI: https://doi.org/10.1289/ehp.1002358
6. Motoyoshi Y., Kaminoda K., Saitoh O. et al. Different mechanisms for anti-tumor effects of low- and high-dose cyclophosphamide. Oncol. Rep. 2006; 16 (1): 141-6.
7. Mahajan V.S., Leskov I.B., Chen J.Z. Homeostasis of T cell diversity. Cell. Mol. Immunol. 2005; 2 (1): 1-10.
8. Sallusto F., Geginat J., Lanzavecchia A. Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance. Annu. Rev. Immunol. 2004; 22: 745-63. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.22.012703.104702
9. Boyman O., Letourneau S., Krieg C., Sprent J. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. Eur. J. Immunol. 2009; 39 (8): 2088-94. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.200939444
10. Стеценко О.Н., Борзова Н.В., Линднер Д.П., Иванова А.С. Влияние иммуномодулятора полиоксидония на восстановление костного мозга, поврежденного действием гидрокортизона и циклофосфана. Иммунология. 2005; 26 (1): 27-32.
11. Artym J., Zimecki M., Kruzel M.L. Reconstitution of the cellular immune response by lactoferrin in cyclophosphamide-treated mice is correlated with renewal of T cell compartment. Immunobiology. 2003; 207 (3): 197-205. DOI: https://doi.org/10.1078/0171-2985-00233.
12. Jung J.Y., Shin J.S., Rhee Y.K. et al. In vitro and in vivo immunostimulatory activity of an exopolysaccharide-enriched fraction from Bacillus subtilis. J. Appl. Microbiol. 2015; 118 (3): 739-52. DOI: https://doi.org/10.1111/jam.12742
13. Feng H., Fan J., Lin L. et al. Immunomodulatory effects of phosphorylated radix cyathulae officinalis polysaccharides in immunosuppressed mice. Molecules. 2019; 24 (22): 4150. Published 2019 Nov 15. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules24224150
14. Schiavoni G., Mattei F., Di Pucchio T. et al. Cyclophosphamide induces type I interferon and augments the number of CD44(hi) T lymphocytes in mice: implications for strategies of chemoimmunotherapy of cancer. Blood. 2000; 95 (6): 2024-30.
15. Kuwatani M., Ikarashi Y., Mineishi S. et al. An irradiation-free nonmyeloablative bone marrow transplantation model: importance of the balance between donor T-cell number and the intensity of conditioning. Transplantation. 2005; 80 (9): 1145-52. DOI: https://doi.org/10.1097/01.tp.0000183289.79693.3d
16. Ramirez D.A., Collins K.P., Aradi A.E. et al. Kinetics of cyclophosphamide metabolism in humans, dogs, cats, and mice and relationship to cytotoxic activity and pharmacokinetics. Drug Metab. Dispos. 2019; 47 (3): 257-68. DOI: https://doi.org/10.1124/dmd.118.083766
17. Arai Y., Choi U., Corsino C.I. et al. Myeloid conditioning with c-kit-Targeted CAR-T cells enables donor stem cell engraftment. Mol. Ther. 2018; 26 (5): 1181-97. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2018.03.003
18. Milicevic N.M., Milicevic Z. Restriction of regenerative capacity of the rat thymus after the application of cyclophosphamide. J. Comp. Pathol. 1984; 94 (3): 425-31.
19. Prakash, Gupta V., Singh S.M. et al. Effect of intrauterine exposure of murine fetus to cyclophosphamide on development of thymus. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 2007; 29 (1): 17-30. DOI: https://doi.org/10.1080/08923970701277635
20. Лебединская Е.А., Лебединская О.В., Годовалов А.П. и др. Морфологические характеристики индуцированной иммуносупрессии. В сб.: Новые задачи современной медицины : материалы I Международной научной конференции (г. Пермь, январь 2012 г.). Пермь : Меркурий, 2012: 63-7.
21. Huyan X.H., Lin Y.P., Gao T. et al. Immunosuppressive effect of cyclophosphamide on white blood cells and lymphocyte subpopulations from peripheral blood of Balb/c mice. Int. Immunopharmacol. 2011; 11 (9): 1293-7. DOI: https://doi.org/10.1016/j.intimp.2011.04.011