Иммунология

Введение. Пандемия новой коронавирусной инфекции продолжается по сей день, в связи с чем сохраняют актуальность исследования, направленные на поиск новых способов прогнозирования и лечения COVID-19. Особое внимание уделяется рецепторам, необходимым вирусу для проникновения в клетку, как мишеням для терапии и молекулярно-генетического прогноза.

Цель - определить аллельные варианты генов ACE1 и ACE2, а также их комбинации, у русских жителей Челябинской области, переболевших COVID-19 с осложнением в виде двусторонней вирусной пневмонии.

Материал и методы. Полиморфные варианты ACE1 I/D и ACE2 G8790A определены методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Поскольку ген АСЕ2 расположен на Х-хромосоме, анализ распределения аллелей полиморфного локуса ACE2 G8790A проведен с учетом половой принадлежности.

Результаты. Установлено, что генотип ACE2(8790)*GА реже встречался у пациентов женщин по отношению к группе сравнения (16 и 42 % соответственно, p = 0,004). У пациентов женщин чаще встречались генотип ACE2(8790)*GG и сочетание ACE1*DD/ACE2*GG, связанное с пониженной экспрессией АСЕ2 и повышенной экспрессией АСЕ1 (77 и 19 % соответственно). У гемизиготных мужчин, напротив, чаще встречался аллель ACE2(8790)*A и сочетание ACE1*ID/ACE2*A, связанные с более высокой продукцией ACE2 (35 и 18 %, соответственно).

Заключение. Факторы предрасположенности к COVID-19 системы АСE1-2 отличаются у мужчин и женщин.

Введение. В-клетки являются привлекательной мишенью для генной терапии. С помощью переноса генов в В-клетки можно лечить заболевания, связанные с генетически обусловленной дисфункцией В-клеток, а также лимфопролиферативные и аутоиммунные патологии. В последние годы для переноса генов все большую популярность приобретают векторы на основе аденовирусов (Ad). Этому способствуют такие свойства Ad, как высокая емкость в отношении трансгена, возможность нарабатывать вектор в высоких титрах, а также способность трансдуцировать терминально дифференцированные клетки.

Цель исследования - определить эффективность трансдукции В-клеточных линий человека, а также активированных первичных В-лимфоцитов аденовирусными векторами различных серотипов.

Материал и методы. Мононуклеарные клетки выделяли из периферической крови здоровых доноров (n = 11) с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла-верографина с дальнейшим обогащением фракции В-лимфоцитов методом отрицательной селекции с использованием магнитных микросфер. В-лимфоциты стимулировали in vitro с помощью смеси лимфокинов, в состав которой входили ИЛ-2, ИЛ-4, BAFF, ИЛ-21 и мультимеризованный CD40L. Через 24 ч стимулированные В-лимфоциты инфицировали рекомбинантными аденовирусными векторами, несущими репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP). Были протестированы 3 серотипа: Ad5, sAd23 и Ad26, а также химерный Аd5-вектор, содержавший на С-конце своего фибера соответствующий домен серотипа Ad35 (Ad5/35). Через 48 ч после инфекции определяли долю трансдуцированных клеток и среднюю интенсивность флуоресценции репортерного белка GFP. Трансдукцию определяли на четырех В-клеточных линиях: NALM-6, Ramos, IM-9 и RPMI-8226, а также на первичных В-лимфоцитах. Для сравнения с В-клетками использовали нелимфоидную линию HEK293.

Результаты. Ad в низких и средних дозах оказывали на клетки умеренное токсическое воздействие, при этом жизнеспособность оставалась не ниже 70 %. Наиболее восприимчивыми к аденовирусной инфекции проявили себя клетки RPMI-8226, у которых после трансдукции > 90 % клеток экспрессировали GFP. По этому показателю они приближались к нелимфоидным клеткам HEK293.

Наиболее устойчивыми к аденовирусной инфекции оказались клетки NALM-6 - они в некоторой степени трансдуцировались векторами Ad26 и Ad35 (65 и 66 %), незначительно - вектором sAd23 (18 %) и минимально - вектором Ad5. Клетки Ramos и IM-9 по чувствительности к инфекции занимали промежуточное положение, при этом клетки Ramos трансдуцировались несколько более успешно, чем IM-9. При сравнении различных серотипов наиболее инфекционным оказался Ad26, который даже в минимальных дозах трансдуцировал > 90 % клеток Ramos, IM-9 и RPMI-8226.

В отношении стимулированных первичных В-лимфоцитов наибольшей трансдуцирующей эффективностью обладал вектор Ad26. При дозе вируса 2000 БОЕ/клетку медианное значение доли GFP⁺-клеток составляло 35 % (межквартильный размах - 30-40 %). Несколько меньшую активность проявлял Ad5/35 (медианное значение 16 %, межквартильный размах 13-20 %). Наконец Ad5 и sAd23 имели самую низкую трансдуцирующую активность, которая устойчиво превышала пороговый уровень только при самых высоких дозах вируса (от 1000 до 2000 БОЕ/клетку).

Заключение. Серотипы Ad отличаются между собой по способности трансдуцировать В-клетки человека. Наиболее эффективную трансдукцию обеспечивает серотип Ad26. Несколько сниженной эффективностью обладает вектор Ad5, псевдотипированный фибером Ad35. Трансдукция первичных В-лимфоцитов проходит только после их активации.

Введение. Количественное определение химеризма после аллогенной трансплантации костного мозга (аТКМ) - один из основных методов оценки приживления аллотрансплантатов (в том числе при трансплантации васкуляризированных композитных комплексов тканей - ВКА) от того же донора. Полный стабильный химеризм коррелирует с длительным приживлением донорских тканей. Многократные исследования химеризма в динамике необходимы для оценки эффективности трансплантации с возможностью последующей отмены иммуносупрессивной терапии.

Цель работы - оценить гемопоэтический химеризм у минипигов после аТКМ при индукции иммунной толерантности к ВКА.

Материал и методы. Исследование проводили на минипигах гибридах пород Визенау и Вьетнамской вислобрюхой. Химеризм исследовали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на "0", "+14", "+21" и "+30" дни с использованием набора реагентов COrDIS PIG (ООО "ГОРДИЗ", Россия). Анализ результатов ПЦР проводили методом капиллярного электрофореза с использованием автоматического генетического анализатора (ABI PRISM 3500, Thermo Fisher Scientific, США). Полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения GeneMapper (Thermo Fisher Scientific, США). Аллели оценивали по 15 микросателлитным маркерам для каждого образца крови минипига, высчитывали процентное содержание аллелей донора и реципиента при анализе химеризма.

Результаты. Было исследовано 9 пар экспериментальных животных (донор-реципиент). У 5 реципиентов на +30 сутки после аТКМ в аспирате костного мозга определялись только собственные аллели. У 4 реципиентов наблюдался смешанный донорский химеризм. Методика показала чувствительность не менее 5 % в модельном эксперименте. Погрешность определения зависит от количества взятых в анализ локусов и не превышает 10 % при содержании аллелей донора 50 % в исследуемом образце.

Заключение. Определение донорского химеризма у минипигов после аТКМ при индукции иммунной толерантности к ВКА продемонстрировало динамику приживления ТКМ и максимальную экспансию донорскими клетками костного мозга реципиента до 80-90 %. Метод определения химеризма с помощью STR-локусов обладает высокой чувствительностью и может быть использован в модельных экспериментах с минипигами.

Введение. Мукозальный путь иммунизации много лет остается в сфере внимания исследователей и вакцинопрофилактика COVID-19 не стала исключением. Один из объективных параметров оценки иммунологической эффективности - сенсибилизация Т-клеток в крови переболевших COVID-19 или получивших вакцинопрофилактику здоровых добровольцев. Оценка Т-клеточного иммунитета к SARS-CoV-2 важна не только для стратификации рисков и определения потенциально защищенных групп населения с иммунитетом, приобретенным вследствие перенесенной инфекции, но и для оценки иммуногенности и потенциальной эффективности разрабатываемых вакцин. Представлены результаты промежуточного анализа данных, полученных в рамках рандомизированного двойного слепого многоцентрового клинического исследования III фазы двухкомпонентной вакцины для профилактики COVID-19 с интраназальным (ИН) и внутримышечным (ВМ) путем введения.

Цель - оценить динамику Т-клеточного ответа к различным пептидам SARS-CoV-2 на фоне ИН и ВМ иммунизации двухкомпонентной векторной вакциной для профилактики развития COVID-19.

Материал и методы. В общей сложности 137 здоровых добровольцев с исходным уровнем анти-RBD-IgG-антител ≤ 100 BAU/мл были иммунизированы двухкомпонентной векторной вакциной (на основе Ad26 и Ad5) с ИН или ВМ путем введения в день 1 и день 21. Оценку иммуногенности проводили на основании изучения Т-клеточного ответа с использованием технологии IGRA-ELISPOT на 21-й и 42-й день после введения компонента I.

Результаты. Доля пациентов с сенсибилизацией Т-клеток к SARS-CoV-2 достоверно выросла на фоне ИН (с исходного уровня 33,9 % до 55,93 % на 42-й день) и ВМ (с исходного уровня 30,51 % до 61,02 % на 42-й день) иммунизации, она была сопоставима между группами на всех визитах. Получены данные о статистически значимом росте количества Т-клеток, специфичных к белку шипа (S) SARS-CoV-2 (суммарно CD8⁺ и CD4⁺) на фоне отсутствия сенсибилизации данных клеток к белкам N, M, ORF3a и ORF7a.

Заключение. Показан иммуногенный потенциал двухкомпонентной векторной вакцины (на основе Ad26 и Ad5) с ИН или ВМ путем введения с клональной активацией Т-клеток к белку шипа (S) SARS-CoV-2.

Введение. Систематическое изучение структурных и количественных показателей сенсибилизации к тем или иным аллергенам имеет эпидемиологическое значение. В нашей стране профили гиперчувствительности к ингаляционным аллергенам имеют свои региональные отличия, обусловленные климатогеографической компонентой.

Цель - изучение профиля сенсибилизации к ингаляционным аллергенам в Московском регионе.

Материал и методы. Методом постановки скарификационных кожных проб были обследованы 72 человека от 4 до 62 лет (50 мужчин и 22 женщины). Использовали аллергенные экстракты (АГ) клещей домашней пыли Dermatophagoidas pteronyssinus (АГ1), D. farina (АГ2), пыльцы березы повислой (Betula pendula Roth) (АГ3), ольхи клейкой (Alnus glutinosa) (АГ4), лещины обыкновенной (Corylus avellana) (АГ5), ежи сборной (Dactylis glomerata) (АГ6), тимофеевки луговой (Phleum pratense) (АГ7). Специфические поликлональные антисыворотки (ПА) получали путем иммунизации кроликов АГ каждые 28 дней в течение 4 мес. Активность ПА определяли методом обратного иммуноферментного анализа.

Результаты. Количество случаев выявления гиперчувствительности убывает в следующем ряду АГ: АГ3, АГ5, АГ4, АГ7, АГ6, АГ2, АГ1 (80,56; 72,22; 70,83; 44,44; 43,06; 31,94 и 29,17 % соответственно). Частота случаев выявления сенсибилизации к одному (АГ2 или АГ3, или АГ7), двум (АГ3 + АГ4; АГ3 + АГ5; АГ6 + АГ7; АГ1 + АГ2), трем (АГ3 + АГ4 + АГ5; АГ3 + АГ6 + АГ7; АГ1 + АГ2 + АГ3), четырем (АГ1 + АГ2 + АГ6 + АГ7; АГ3 + АГ4 + АГ5 + АГ7; АГ1 + АГ2 + АГ3 + АГ5), пяти (АГ3 + АГ4 + АГ5 + АГ6 + АГ7; АГ1 +АГ2 + АГ3 + АГ4 + АГ5), шести (АГ2 + АГ3 + АГ4 + АГ5 + АГ6 + АГ7) и семи АГ одновременно составляет 4,17; 16,67; 38,88; 5,56; 23,61; 1,39 и 9,72 % соответственно. Степени связывания ПА, полученной против АГ3, с АГ4, АГ5, АГ6, АГ7 составили 115,15; 70,26; 23,96 и 35,91 % соответственно. Степени связывания ПА, полученной против АГ4, с АГ3, АГ5, АГ6, АГ7 - 20,47; 21,46; 2,25 и 1,71 % соответственно. Степени связывания ПА, полученной против АГ5, с АГ3, АГ4, АГ6, АГ7 - 60,22; 47,6; 0 и 9,98 % соответственно. Степени связывания ПА, полученной против АГ6, с АГ3, АГ4, АГ5, АГ7 - 8,09; 44,71; 8,97 и 94,71 % соответственно. Степени связывания ПА, полученной против АГ7, с АГ3, АГ4, АГ5, АГ6 - 12,17; 33,52; 5,16 и 89,78 % соответственно. Степень связывания ПА, полученной против АГ1, с АГ2 - 93,89 %. Степень связывания ПА, полученной против АГ2, с АГ1 - 54,74 %.

Заключение. Частота выявления полисенсибилизации составляет 95,86 %, при этом к разным комплексам аэроаллергенов она убывает в ряду: АГ3 + АГ4 + АГ5; АГ3 + АГ4 + АГ5 + АГ6 + АГ7; АГ1 + АГ2 + АГ3 + АГ4 + АГ5 + АГ6 + АГ7; АГ6 + АГ7; АГ1 + АГ2; АГ1 + АГ2 + АГ3 + АГ4 + АГ5 (33,33; 18,06; 9,72; 6,94; 6,94 и 5,56 %). По сравнению с данными 2012 г., число людей с гиперчувствительностью к пыльцевым АГ увеличилось на 15,52 %. Распространенность гиперчувствительности к АГ клещей домашней пыли уменьшилась практически в 2 раза по сравнению с данными 2009 г.

Введение. Блокада рецепторов иммунных контрольных точек (immune checkpoint blockade, ICB) - это одно из эффективных направлений современной иммунотерапии пациентов со злокачественными новообразованиями. Клиницисты используют блокирующие антитела к рецепторным белкам PD1, PD-L1, LAG3, экспонированным на различных типах клеток, включая Т-, НК-, В-клетки, а также миелоидные клетки микроокружения и непосредственно злокачественные клетки опухоли. Широкий опыт применения ICB показал значительные различия в клинической эффективности различных препаратов и их комбинаций. Стала очевидной актуальная задача разработки широкого спектра новых препаратов для ICB. В свою очередь, для разработки новых чекпойнт-блокаторов требуются удобные и эффективные экспериментальные модели, с помощью которых можно было бы проводить скрининг существующих и вновь разработанных лекарственных веществ.

Цель. Данная работа посвящена разработке и детальному изучению двух экспериментальных моделей для обнаружения и характеристики новых чекпойнт-блокаторов.

Материал и методы. Для анализа блокады сигнальной оси PD1 → PD-L1 использованы трансдуцированные клетки линии HEK293-PD1, устойчиво экспрессирующие на своей поверхности рецепторный белок PD1. Одна из двух разработанных экспериментальных моделей исследует ингибирование взаимодействия растворимого рекомбинантного белка PD-L1-Fc, меченого биотином, с клетками линии HEK293-PD1. Во второй экспериментальной модели мы анализируем ингибирование взаимодействия меченого флуорохромом антитела к PD1 с клетками HEK293-PD1. Связывание меченых лигандов с клетками исследовали методом проточной цитофлуориметрии. Об ингибировании связывания судили по изменению интенсивности флуоресценции меченых клеток.

Результаты. В разработанных экспериментальных моделях исследованы блокирующие свойства терапевтических антител к PD1 и PD-L1, а также растворимых рекомбинантных белков PD-L1-Fc и PD1-Fc. Показана высокая чувствительность предложенных экспериментальных моделей, позволяющая не только установить наличие блокирующих свойств любого вещества на взаимодействие PD-L1 с PD1, но и определить удельную активность блокаторов PD-L1 и PD1 с полумаксимальной константой ингибирования (K₅₀) в области наномолярных концентраций исследуемого вещества. Авторы считают, что предложенный подход можно использовать для создания экспериментальных моделей с любыми клеточными рецепторами в качестве молекулярных мишеней ингибирования.

Введение. Лечение злокачественных опухолей - одна из наиболее актуальных задач современной медицины. Перепрограммирование опухоль-ассоциированных макрофагов в противоопухолевые клетки-эффекторы - перспективное направление в иммунотерапии онкологических заболеваний. Сильными индукторами противоопухолевой активности макрофагов являются сигналы от паттерн-распознающих рецепторов (ПРР) врожденного иммунитета. Ранее мы показали, что сочетание агонистов NOD1 и TLR4 эффективно индуцирует активность макрофагов против клеток эритромиелоидного лейкоза K562 [1].

Цель настоящей работы - изучение активности макрофагов человека, стимулированных агонистом рецептора NOD1 в сочетании с агонистами TLR4 и TLR7/8, против клеток диссеминированных и солидных опухолей, а также анализ механизмов противоопухолевой активности макрофагов.

Материал и методы. В качестве мишеней для макрофагов использовали клетки эритромиелоидной линии К562, клетки человеческой эпителиоидной карциномы шейки матки линии HeLa и клетки человеческой колоректальной карциномы линии HT29, несущие ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). Клетки опухоли инкубировали совместно с макрофагами в присутствии агонистов NOD1, TLR4, TLR7/8 раздельно и в сочетании. В качестве контроля выступали опухолевые клетки без макрофагов. Для анализа антипролиферативных свойств макрофагов проводили анализ клеточного цикла опухолевых клеток с помощью проточной цитометрии. Количество погибших клеток определяли с помощью окрашивания аннексином-V и пропидий-иодидом. Экспрессию мРНК TNF в макрофагах оценивали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с обратной транскрипцией.

Результаты. Сочетания агонистов NOD1+TLR4 и NOD1+TLR7/8 эффективно индуцировали активность макрофагов против клеток K562, HeLa и HT29. Активность сочетаний агонистов во всех случаях была выше, чем активность отдельно взятых агонистов. Макрофаги, активированные сочетанием агонистов NOD1+TLR4, тормозили пролиферацию опухолевых клеток K562 и усиливали их гибель.

Обсуждение содержит анализ полученных данных и оценку применимости предложенных моделей репрограммирования макрофагов в отношении различных опухолевых клеточных линий.

Заключение. Сочетания агонистов NOD- и Toll-подобных рецепторов эффективно индуцируют активность макрофагов против опухолевых клеточных линий, полученных из диссеминированных и солидных опухолей.

Введение. Расширение спектра молекулярных прогностических и предиктивных маркеров опухолей - это современный тренд, направленный на повышение эффективности лекарственной терапии опухолей разного генеза, включая рак яичников, результаты лечения которого остаются неудовлетворительными. В этой связи значительным потенциалом обладает белок цитоскелета TUBB3, который экспрессируется в эпителиальных опухолях. В фундаментальных исследованиях доказано, что гиперэкспрессия TUBB3 повышает метастатический потенциал опухолевых клеток и индуцирует резистентность к широкому кругу лекарств. Однако в трансляционных исследованиях при полуколичественном анализе экспрессии TUBB3 оценки вклада этого белка в агрессивность рака яичников и эффективность химиотерапии неоднозначны.

Цель исследования - количественная оценка показателей экспрессии TUBB3 в ткани рака яичников и определение корреляции выявленных параметров с клиническими характеристиками новообразования.

Материал и методы. Исследованы хирургические образцы ткани рака яичников (n = 51). Использованы первичные моноклональные антитела к TUBB3 (клон EP1569Y, Abcam, Великобритания) и вторичные антитела, конъюгированные с красителем DyLight650 (ab98510, Abcam, Великобритания). Уровень флуоресценции измеряли на проточном цитометре Navios (Beckman Coulter, США). Количество окрашенных клеток определяли в программе FlowJo 10.0.8 (США) методом Колмогорова-Смирнова. Рассчитаны три показателя экспрессии TUBB3: уровень (%), интенсивность (усл. ед.), индекс (усл. ед.). Статистический анализ нормальности распределения показателей экспрессии TUBB3, сравнения выборок и оценки корреляции проведены в программе GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, США).

Результаты. В исследованной выборке опухолей TUBB3 выявлен в 100 % случаев при значительных различиях количественных показателей (до 10 раз) у разных пациенток, что совпадает с клиническими данными о гетерогенности ответа пациенток на лекарственную терапию и сроков общей выживаемости. Выявлены слабая ассоциативная связь между уровнем и интенсивностью экспрессии TUBB3 и отсутствие различий в показателях в зависимости от стадии рака яичника и степени дифференцировки опухоли. При сравнительном исследовании у одних и тех же пациенток первичного и метастатического рака яичников (опухолевые клетки из асцитической жидкости при канцероматозе брюшины) стабильность молекулярного фенотипа продемонстрирована менее чем в 40 % случаев. У остальных пациенток уровень экспрессии TUBB3 в опухолевых клетках в половине случаев увеличился, в половине - уменьшился.

Заключение. Количественный иммунофлуоресцентный анализ экспрессии TUBB3 в ткани рака яичников выявил этот белок в 100 % случаев при медиане уровня экспрессии TUBB3 55 % и выраженной гетерогенности показателей у разных пациенток. Не выявлено различий по уровню, интенсивности и индексу экспрессии TUBB3 в зависимости от стадии заболевания и степени дифференцировки опухоли. Разнонаправленные изменения уровня экспрессии TUBB3 отмечены в клетках метастатического рака яичников по сравнению с первичной опухолью тех же пациенток. Сформированная база данных позволит провести точный анализ предиктивной значимости экспрессии TUBB3 в опухоли и определить количественные показатели, которые вносят вклад в лекарственную резистентность.

Исследование посвящено сбору, анализу, объединению и интерпретации данных о подходах и дизайне валидации методик фенотипирования клеточных линий с использованием проточной цитометрии из работ различных групп авторов на протяжении двух десятилетий. На основании изученных научных данных в работе представлены результаты в виде алгоритма валидации методик фенотипирования клеточных линий, включающего шаги по описанию стратегии валидации и ее проведения, получению и анализу данных, а также по определению критериев приемлемости.